ՏՐԱՆՍԿՐԻՊՏՈՄԻԿԱ
բնությունը
ՀԱՂՈՐԴԱԿՑՈՒԹՅՈՒՆՆԵՐ
Քրոնիկ լիմֆոցիտային լեյկոզում SF3B1 մուտացիայի ամբողջական տառադարձման բնութագրումը բացահայտում է պահպանված ինտրոնների անկարգավորումը
Ամբողջական սղագրություններ|Nanopore sequence|Այլընտրանքային իզոֆորմների վերլուծություն
Նախապատմություն
SՍփլայզինգային գործոնի SF3B1 օմատիկ մուտացիաները լայնորեն կապված են քաղցկեղի տարբեր տեսակների հետ, ներառյալ քրոնիկ լիմֆոցիտային լեյկոզը (CLL), ուվեալ մելանոման, կրծքագեղձի քաղցկեղը և այլն:Այնուամենայնիվ, այս այլընտրանքային միաձուլման օրինաչափությունների վերաբերյալ ուսումնասիրությունները երկար ժամանակ սահմանափակված են եղել իրադարձությունների մակարդակով և իզոֆորմի մակարդակի վերաբերյալ գիտելիքների բացակայությամբ՝ կարճ ընթերցված հավաքված տառադարձումների սահմանափակության պատճառով:Այստեղ նանոպորների հաջորդականության հարթակը ներկայացվեց՝ լիամետրաժ տառադարձումներ ստեղծելու համար, ինչը հնարավորություն տվեց AS-ի իզոֆորմների հետախուզմանը:
Փորձարարական դիզայն
Փորձարկումներ
Խմբավորում:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E մուտացիա);3. Նորմալ B-բջիջներ
Հերթականության ռազմավարություն.MinION 2D գրադարանների հաջորդականություն, PromethION 1D գրադարանների հաջորդականություն;կարճ ընթերցված տվյալներ նույն նմուշներից
Հերթականության հարթակ.ONT MinION;ONT PromethION;
Կենսաինֆորմատիկական վերլուծություն
Արդյունքներ
ԱԸնդհանուր առմամբ 257 միլիոն ընթերցում է ստացվել 6 CLL նմուշներից և 3 B-բջիջներից:Միջին հաշվով, այս ընթերցումների 30,5%-ը ճանաչվել է որպես ամբողջական սղագրություն:
FՌՆԹ-ի (FLAIR) այլընտրանքային իզոֆորմների ամբողջական վերլուծությունը մշակվել է բարձր վստահության իզոֆորմների մի շարք ստեղծելու համար:FLAIR-ը կարելի է ամփոփել հետևյալ կերպ.
Nanopore-ը կարդում է հավասարեցում. բացահայտել տառադարձման ընդհանուր կառուցվածքը՝ հիմնվելով հղումային գենոմի վրա.
Sշրթունքների միացման ուղղում. ուղղել հաջորդականության սխալները (կարմիր) միացման տեղամասով կամ ծանոթագրված ինտրոններից, ինտրոններից կարճ ընթերցված տվյալներից կամ երկուսն էլ.
Cոլապս. ամփոփել ներկայացուցչական իզոֆորմները՝ հիմնված միաձուլման միացման շղթաների վրա (առաջին անցման հավաքածու):Ընտրեք բարձր վստահությամբ isof-ից՝ հիմնված ընթերցումների քանակի վրա (շեմ՝ 3):
Նկար 1. FLAIR վերլուծություն՝ CLL-ում SF3B1 մուտացիայի հետ կապված ամբողջական իզոֆորմները բացահայտելու համար
FLAIR-ը հայտնաբերել է 326699 բարձր վստահությամբ միացված իզոֆորմներ, որոնց 90%-ը նոր իզոֆորմներ են:Պարզվել է, որ այս չնշված իզոֆորմներից շատերը հայտնի միաձուլման միացումների նոր համակցություններ են (142,971), մինչդեռ մնացած նոր իզոֆորմները պարունակում են կա՛մ պահպանված ինտրոն (21,700) կա՛մ նոր էկզոն (3594):
Lերկար ընթերցված հաջորդականությունները թույլ են տալիս նույնականացնել մուտանտ SF3B1-K700E-փոփոխված միացման վայրերը իզոֆորմի մակարդակում:Պարզվել է, որ 35 այլընտրանքային 3'SS և 10 այլընտրանքային 5'SS-ներ էականորեն տարբերվում են SF3B1-K700E-ի և SF3B1-WT-ի միջև:35 փոփոխություններից 33-ը նոր են հայտնաբերվել երկար կարդացված հաջորդականությամբ:Nanopore-ի տվյալների համաձայն, SF3B1-K700E-ով փոփոխված 3'SS-ների միջև մինչև կանոնական տեղամասերի գագաթնակետերը հեռավորության բաշխումը կազմում է մոտ -20 bp, ինչը զգալիորեն տարբերվում է հսկիչ բաշխումից, որը նման է CLL-ի կարճ ընթերցման հաջորդականություններին հաղորդվածին:Վերլուծվել են ERGIC3 գենի իզոֆորմները, որտեղ SF3B1-K700E-ում ավելի առատ է հայտնաբերվել նոր իզոֆորմ, որը պարունակում է մոտակա միացման տեղամաս:Ե՛վ պրոքսիմալ, և՛ հեռավոր 3'SS-ը կապված էին տարբեր AS օրինաչափությունների հետ, որոնք առաջացնում էին բազմաթիվ իզոֆորմներ:
Նկար 2. Այլընտրանքային 3' միացման նախշեր, որոնք նույնացվում են նանոպորների հաջորդականության տվյալների հետ
IR իրադարձությունների օգտագործման վերլուծությունը երկար ժամանակ սահմանափակված է եղել կարճ ընթերցման վրա հիմնված վերլուծության մեջ՝ IR նույնականացման և քանակականության նկատմամբ վստահության պատճառով:SF3B1-K700E-ում և SF3B1-WT-ում IR իզոֆորմների արտահայտությունը քանակականացվել է նանոփորերի հաջորդականությունների հիման վրա՝ բացահայտելով SF3B1-K700E-ում IR իզոֆորմների գլոբալ ցածր կարգավորումը:
Գծապատկեր 4. Գյուղատնտեսության ինտենսիվությունը և ցանցային կապը երեք ֆերմերային համակարգերում (A և B);Անտառների պատահական վերլուծություն (C) և կապ գյուղատնտեսության ինտենսիվության և AMF գաղութացման միջև (D)
Գծապատկեր 3. Ինտրոնի վարձակալման իրադարձություններն ավելի խիստ են կարգավորվում CLL SF3B1-K700E-ում
Տեխնոլոգիա
Nanopore Long-read Sequencing
Nanopore sequencing-ը մեկ մոլեկուլի իրական ժամանակում էլեկտրական ազդանշանների հաջորդականության տեխնոլոգիա է:
Dձուլաշղթա ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն կկապվեն նանոծակոտկեն պրոտեինին, որը ներկառուցված է կենսաֆիլմի մեջ և կփաթաթվի շարժիչի սպիտակուցի կապարի տակ:
DNA/RNA շղթաները լարման տարբերության ազդեցության տակ որոշակի արագությամբ անցնում են նանոպորային կապուղու սպիտակուցով:
Mոլեկուլները արտադրում են տարբեր էլեկտրական ազդանշաններ՝ ըստ քիմիական կառուցվածքի:
RՀերթականությունների իրական ժամանակի հայտնաբերումը ձեռք է բերվում բազային զանգի միջոցով:
Ամբողջական տրանսկրիպտոմային հաջորդականության կատարումը
√ Տվյալների հագեցվածություն
Համեմատելի տվյալների հագեցվածության հասնելու համար պահանջվում է 7 անգամ ավելի քիչ ընթերցումներ:
√ Տառագրի կառուցվածքի նույնականացում
Կառուցվածքային տարբեր տարբերակների նույնականացում յուրաքանչյուր տառադարձության համախոհ ամբողջական ընթերցմամբ
√ Տառագրի մակարդակի դիֆերենցիալ վերլուծություն - Բացահայտեք կարճ ընթերցումների միջոցով թաքցված փոփոխությունները
Հղում
Tang AD , Soulette CM , Baren MJV , et al.Քրոնիկ լիմֆոցիտային լեյկեմիայի ժամանակ SF3B1 մուտացիայի ամբողջական տառադարձման բնութագրումը բացահայտում է պահպանված ինտրոնների [J] անկարգավորումը:Բնության հաղորդակցություններ.
Tech and Highlights նպատակ ունի կիսվել տարբեր հետազոտական ասպարեզներում տարբեր բարձր թողունակության հաջորդականության տեխնոլոգիաների վերջին հաջող կիրառմամբ, ինչպես նաև փորձարարական նախագծման և տվյալների արդյունահանման ոլորտում փայլուն գաղափարներով:
Հրապարակման ժամանակը՝ Հունվար-08-2022