BMKCloud Log in
条形banner-03

hírek

METAGENOMIKA

Természet-Biotech

Komplett, zárt bakteriális genomok mikrobiomokból nanopórusos szekvenálás segítségével

Nanopórus szekvenálás |Metagenomika |MAG-ok |Bakteriális genom cirkularizáció |A bél mikrobiota

Kiemelések

1. Ebben a tanulmányban egy új módszert mutattak be hosszú DNS-fragmensek kinyerésére, amellyel 300 mg székletből mikrogramm tiszta, hosszú leolvasású szekvenálásra alkalmas HMW DNS-t sikerült kivonni.

2. Ebben a tanulmányban egy összeszerelési munkafolyamatot, az Esztergat vezettek be, ahol a MAG-okat hosszú leolvasással állították össze, és rövid leolvasással javították ki.

3. Az esztergagépet álkeveréssel értékeltük.12 baktériumból 7 sikeresen egyetlen kontigba, 3 pedig négy vagy kevesebb kontigba állt össze.

4. A székletmintákon esztergagépet alkalmaztunk, amely 20 cirkuláris genomot hozott létre, beleértve a Prevotella copri-t és a jelölt Cibiobacter sp., amelyek mobil genetikai elemekben gazdagok voltak.

Fő eredmény

HWM DNS extrakciós protokollja

A régóta olvasott szekvenáláson alapuló bél metagenomikai vizsgálatokat régóta szenvedték a nagy molekulatömegű (HMW) DNS székletből történő extrakciójának keménysége miatt.Ebben a tanulmányban egy enzim alapú extrakciós protokollt vezettek be, hogy elkerüljék a hagyományos módszerekkel végzett gyöngyverés által okozott kiterjedt nyírást.Amint az a következő ábrán látható, a mintákat először enzimkoktéllal kezelték, beleértve a lítikus enzimet, a MetaPolyzyme-ot stb., hogy lebontsák a sejtfalakat.A felszabadult DNS-t fenol-kloroform rendszerrel extraháltuk, majd Proteináz K és RNáz A emésztést, oszlop alapú tisztítást és SPRI méretválasztást követett.Ezzel a módszerrel 300 m székletből mikrogramm HMW DNS-t sikerült előállítani, amely mind minőségi, mind mennyiségi szempontból megfelel a régóta leolvasott szekvenálási követelményeknek.

5-1024x253

1. ábra: HWM DNS extrakciós séma

Eszterga sémafolyamata

A következő ábrán leírtak szerint az Eszterga a Guppy-t használó nyers alaphívási folyamat meglévő folyamatát tartalmazza.Ezután a Flye és a Canu külön-külön két régóta olvasott összeállítást állít elő, majd a hibás összeállítást észleli és eltávolítja.A két részegységet gyorsösszevonással egyesítik.Egyesítéskor a megabázis szintű nagy szerelvények körkörösségét ellenőrzik.Ezt követően ezekre az összeállításokra vonatkozó konszenzusos finomítást rövid leolvasásokkal dolgozzák fel.A véglegesen összeállított bakteriális genomokat feldolgozzák a végső összeszerelési hibák kimutatása és eltávolítása érdekében.

6-1024x246

2. ábra: Esztergaszerelvény sémafolyamata

Eszterga értékelése álbaktérium keverékkel

A nanopórusos szekvenáló platform és az eszterga MAG összeállításban teljesítményének értékelésére egy standard ATCC 12 fajból álló keveréket használtak, amely Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokat is tartalmazott.Összesen 30,3 Gb adatot generált a nanopórus platform 5,9 kb N50-vel.Az eszterga nagymértékben javította az N50 összeszerelést, 1,6-4-szeresére a többi régóta olvasott összeszerelő szerszámhoz képest, és 2-9-szeresére a hibrid összeszerelő szerszámokhoz képest.A 12 bakteriális genomból hetet egyetlen kontigba állítottak össze (3. ábra: Cirók fekete ponttal).További hármat négy vagy kevesebb kontigba állítottak össze, amelyekben a legtökéletesebb összeállítás a genom 83%-át tartalmazta egyetlen kontigban.

8

3. ábra Genom összeállítások meghatározott 12 fajból álló baktériumkeverékben

Eszterga alkalmazása székletmintákban

Ezt a módszert humán székletmintákra is alkalmazták annak érdekében, hogy összehasonlítsák a szervezet azonosítását és összeállításának kontiguitását a meglévő módszerekkel, olvasás-felhővel és rövid leolvasáson alapuló elemzéssel.A három érintett mintából az új enzimalapú extrakció legalább 1 μg-ot adott 300 mg bemeneti tömegre.Ezeknek a HMW DNS-eknek a nanopórusos szekvenálása hosszú leolvasást eredményezett 4,7 kb, 3,0 kb és 3,0 kb N50-vel.Megjegyzendő, hogy a jelenlegi módszer nagy potenciált mutatott a mikrobiális kimutatásban a meglévő módszerekhez képest.Viszonylag magasabb fajszintű alfadiverzitást mutattak itt a rövid olvasási és olvasási felhőhöz képest.Ezen túlmenően ezzel a módszerrel a rövid leolvasású elemzésből származó összes nemzetséget, még a tipikusan lízisrezisztens Gram-pozitív organizmusokat is kinyertük.

9-1024x656

4. ábra: Nanopore, short-read és read-cloud módszerekkel meghatározott alfadiverzitás és taxanómiai komponensek

Az esztergagép sokkal hosszabb teljes összeállítású N50-et eredményezett, mint a rövid leolvasású és az olvasási felhő összeállítása, annak ellenére, hogy három-hatszor alacsonyabb a nyers adatok bevitele.A genomvázlatokat kontig binning segítségével állítottuk elő, amelyben a piszkozatokat a teljesség, a szennyezettség, az egykópiás maggének stb. alapján „kiváló minőségű” vagy „részleges” kategóriába sorolták. rövid olvasáshoz és olvasási felhőhöz.

10-1024x762

5. ábra. Az egyes módszerek szervezetenkénti összeállításának szomszédossága

Ezenkívül a jelenlegi összeállítási megközelítés zárt, körkörös genomokat eredményez.A székletmintákban nyolc kiváló minőségű, egy-kontig genomot állítottunk össze, és ezek közül öten sikerült percise cirkularizációt elérni.A régóta olvasott megközelítés lenyűgöző képességet mutatott a genomokban lévő ismétlődő elemek feloldásában is.KörbeírvaP. copriA genomot ezzel a megközelítéssel hozták létre, amelyről ismert, hogy nagyfokú szekvencia-ismétlődést tartalmaz.Ennek a genomnak a legjobb összeállítása rövid olvasási és olvasási felhő segítségével soha nem haladta meg a 130 kb-os N50-et, még 4800-szoros lefedettség mellett sem.Ezeket a nagy példányszámú elemeket teljesen feloldották a hosszú olvasási megközelítéssel, amely gyakran a rövid olvasási vagy olvasási felhő összeállítások töréspontjain található.Ebben a tanulmányban egy másik zárt genomról számoltak be, amelyről azt hitték, hogy a nemrégiben leírtak tagjaCibiobacterklád.Öt feltételezett fágot azonosítottak ebben a zárt összeállításban, 8,5 és 65,9 kb között.

11-1024x504

6. ábra P.copri és Cibiobacter sp. zárt genomjainak cirkoszi diagramja.

Referencia

Moss, EL, Maghini, DG és Bhatt, AS (2020).Komplett, zárt bakteriális genomok mikrobiomokból nanopórusos szekvenálás segítségével.Természet biotechnológia,38(6), 701-707.

Technika és kiemelések célja a különböző nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiák legfrissebb sikeres alkalmazásainak megosztása a különböző kutatási színtereken, valamint a briliáns ötletek a kísérleti tervezés és adatbányászat terén.


Feladás időpontja: 2022-07-07

Küldje el nekünk üzenetét: