METAGENOMIKA
Potpuni, zatvoreni bakterijski genomi iz mikrobioma pomoću sekvenciranja nanopora
Sekvenciranje nanopora |Metagenomika |MAGovi |Cirkularizacija bakterijskog genoma |Crijevna mikrobiota
Naglasci
1. Nova metoda za ekstrakciju dugih fragmenata DNK predstavljena je u ovoj studiji, kojom je postignuta ekstrakcija mikrograma čiste, HMW DNK prikladne za dugotrajno sekvenciranje iz 300 mg stolice
2. Tijek rada sastavljanja, Lathe, predstavljen je u ovoj studiji, gdje su MAG-ovi sastavljeni dugim očitavanjem i ispravljeni kratkim čitanjem.
3.Tokarilica je ocijenjena lažnom mješavinom.7 od 12 bakterija uspješno je sklopljeno u pojedinačne kontige, a 3 su sastavljene u četiri ili manje kontiga.
4.Lathe je dalje primijenjen na uzorke stolice, što je generiralo 20 cirkulariziranih genoma, uključujući Prevotella copri i kandidata Cibiobacter sp., koji su bili poznati po tome što su bili bogati mobilnim genetskim elementima.
Glavno postignuće
Protokol ekstrakcije za HWM DNA
Istraživanja metagenomije crijeva koja se temelje na dugotrajnom sekvenciranju dugo su patila od teškoća u izdvajanju DNA velike molekularne težine (HMW) iz stolice.U ovoj studiji uveden je protokol ekstrakcije temeljen na enzimima kako bi se izbjeglo opsežno smicanje mlackanjem u tradicionalnim metodama.Kao što je prikazano na sljedećoj slici, uzorci su prvo tretirani koktelom enzima, uključujući litički enzim, MetaPolyzyme, itd. kako bi se razgradile stanične stijenke.Oslobođena DNA ekstrahirana je sustavom fenol-kloroform, nakon čega je uslijedila digestija proteinazom K i Rnazom A, pročišćavanjem na stupcu i odabirom veličine SPRI.Ova metoda uspjela je dati mikrograme HMW DNA iz 300 m stolice, što ispunjava dugotrajne zahtjeve sekvenciranja u pogledu kvalitete i kvantitete.
Slika 1. HWM shema ekstrakcije DNA
Shema toka Lathe
Kao što je opisano na sljedećoj slici, Lathe sadrži postojeći proces sirovog procesa osnovnog pozivanja pomoću Guppyja.Flye i Canu zatim proizvode dva sklopa za dugo čitanje odvojeno, nakon čega slijedi otkrivanje i uklanjanje pogrešnog sklopa.Dva podsklopa se spajaju brzim spajanjem.Nakon spajanja, veliki sklopovi na razini megabaze zatim se provjeravaju za cirkularizaciju.Naknadno se usavršavanje konsenzusa o tim sklopovima obrađuje kratkim čitanjima.Konačni sastavljeni bakterijski genomi obrađuju se za konačno otkrivanje i uklanjanje pogrešnog sastavljanja.
Slika 2. Shema toka sklopa struga
Procjena tokarilice s mješavinom lažnih bakterija
Standardna mješavina 12 vrsta ATCC koja sadrži Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije korištena je za procjenu performansi platforme za sekvenciranje nanopora i Lathea u MAG sklopu.Ukupno 30,3 Gb podataka generirano je nanopore platformom s N50 od 5,9 kb.Tokarski stroj uvelike je poboljšao montažu N50 na 1,6 do 4 puta u usporedbi s drugim dugotrajnim alatima za montažu i 2 do 9 puta u usporedbi s hibridnim alatima za montažu.Od 12 bakterijskih genoma, sedam je sastavljeno u pojedinačne kontigove (Slika 3. Circos s crnom točkom).Još tri su sastavljena u četiri ili manje kontiga, u kojima je najnepotpuniji sklop sadržavao 83% genoma u jednom kontigu.
Slika 3. Skupovi genoma u definiranoj mješavini bakterija od 12 vrsta
Primjena Lathea u uzorcima stolice
Ova je metoda dalje primijenjena na uzorke ljudske stolice kako bi se usporedila identifikacija organizma i kontiguitet sklopa s postojećim metodama, analizom temeljenom na čitanju u oblaku i kratkom čitanju.Od tri uključena uzorka, nova ekstrakcija temeljena na enzimima dala je najmanje 1 μg na 300 mg ulazne mase.Sekvenciranje nanopora ove HMW DNK generira dugo očitavanje s N50 od 4,7 kb, 3,0 kb i 3,0 kb respektivno.Značajno je da je sadašnja metoda pokazala veliki potencijal u detekciji mikroba u usporedbi s postojećim metodama.Ovdje je prikazana relativno veća alfa raznolikost na razini vrste u usporedbi s kratkim čitanjem i čitanjem u oblaku.Štoviše, svi rodovi iz analize kratkog očitavanja, čak i obično gram-pozitivni organizmi otporni na lizu, izdvojeni su ovom metodom.
Slika 4. Alfa raznolikost i taksanomske komponente određene metodama Nanopore, kratkog čitanja i čitanja u oblaku
Lathe je dao puno duži cijeli sklop N50 nego sklop za kratko čitanje i čitanje u oblaku, unatoč tri do šest puta nižem unosu sirovih podataka.Nacrti genoma proizvedeni su contig binningom, u kojem su nacrti klasificirani u "visokokvalitetne" ili "djelomične" na temelju potpunosti, kontaminacije, jedne kopije jezgrenih gena, itd. Dugoročno čitanje pokazalo je mnogo veću povezanost po nižoj cijeni u usporedbi na kratko čitanje i čitanje u oblaku.
Slika 5. Kontinuitet sklopa po organizmu svake metode
Štoviše, sadašnji pristup sklapanja sposoban je dati zatvorene, kružne genome.U uzorcima stolice sastavljeno je osam visokokvalitetnih genoma s jednim kontigom, a pet od njih postiglo je preciznu cirkularizaciju.Dugotrajni pristup također je pokazao impresivan kapacitet u rješavanju ponavljajućih elemenata u genomima.CirkulariziranoP. copriGenom je generiran ovim pristupom, za koji je poznato da sadrži visok stupanj ponavljanja sekvence.Najbolji sklop ovog genoma pomoću kratkog čitanja i čitanja u oblaku nikada nije premašio N50 od 130 kb, čak ni uz dubinu pokrivenosti od 4800X.Ovi elementi velikog broja kopija u potpunosti su riješeni pristupom dugog čitanja, koji se često nalazi na prijelomnim točkama sklopova kratkog čitanja ili čitanja u oblaku.Još jedan zatvoreni genom prijavljen je u ovoj studiji, za koji se vjeruje da je član nedavno opisanogCibiobacterklada.Pet navodnih faga identificirano je u ovom zatvorenom sklopu, u rasponu od 8,5 do 65,9 kb.
Slika 6. Circosov dijagram zatvorenih genoma P.copri i Cibiobacter sp.
Referenca
Moss, EL, Maghini, DG i Bhatt, AS (2020).Potpuni, zatvoreni bakterijski genomi iz mikrobioma pomoću sekvenciranja nanopora.Biotehnologija prirode,38(6), 701-707.
Tehnika i vrhunci ima za cilj podijeliti najnoviju uspješnu primjenu različitih tehnologija sekvenciranja visoke propusnosti u raznim istraživačkim arenama, kao i briljantnih ideja u eksperimentalnom dizajnu i rudarenju podataka.
Vrijeme objave: 7. siječnja 2022