LJUDSKA GENOMIKA
prirodna genetika
Sekvenciranje dugotrajnog čitanja identificira ekspanzije ponavljanja GGC u NOTCH2NLC povezane s bolešću intranuklearne inkluzije neurona
ONT ponovno sekvenciranje |Illumina |Sekvenciranje cijelog egzoma |CRISPR-Cas9 ONT ciljano sekvenciranje |RNA-seq |ONT 5mC poziv metilacije
Naglasci
1. Analizom povezivanja na velikoj obitelji NIID identificirana su dva povezana područja.
2. ONT sekvenciranje temeljeno na dugom čitanju i obogaćivanje posredovano Cas-9 ONT sekvenciranje otkrilo je potencijalni genetski uzrok NIID, ekspanzija ponavljanja GGC u 5′ UTR od NOTCH2NLC.Ova studija je prvi put izvijestila o ponovljenim ekspanzijama u genima specifičnim za ljude koji su evoluirali kroz segmentna dupliciranja.
3. Sekvenciranje RNK otkrilo je abnormalne antisense transkripte na početku ili unutar GGC ponovljenih ekspanzijskih regija u NOTCH2NLC.
Pozadina
NEuronal intranuclear inclusion disease (NIID) je progresivna i smrtonosna neurodegenerativna bolest koju karakterizira prisutnost eozinofilnih hijalinskih intranuklearnih inkluzija u središnjem i perifernom živčanom sustavu.Njegove vrlo varijabilne kliničke manifestacije stvaraju velike poteškoće u dijagnostici sve do uvođenja biopsije kože.Međutim, metode temeljene na histopatologiji još uvijek pate od pogrešnih dijagnoza, što zahtijeva genetsko razumijevanje NIID-a.
Dostignuća
Analiza povezivanja
SHort-read sekvenciranje temeljeno na sekvenciranju cijelog genoma (WGS) i sekvenciranju cijelog egzoma (WES) provedeno je na velikoj obitelji NIID (13 zahvaćenih i 7 nezahvaćenih članova).Analiza povezivanja SNP-ova izdvojenih iz ovih podataka otkrila je samo dvije povezane regije: regiju od 3,5 Mb na 1p36.31-p36.22 (maksimalni LOD=2,32) i regiju od 58,1 Mb na 1p22.1-q21.3 (maksimalni LOD: 4,21 ).Međutim, u tim povezanim regijama nisu identificirani patogeni SNP-ovi ili CNV-ovi.
GGC ponavljaju ekspanzije u NOTCH2NLC
Nsekvenciranje temeljeno na anoporama obrađeno je na 13 zahvaćenih i 4 nezahvaćena člana iz 8 obitelji (još jedan zahvaćeni član sekvencioniran je Pacbio platformom za dugo čitanje sekvenciranja.).Dugo očitani podaci otkrili su ekspanzije ponavljanja GGC povezane s bolešću u 5' UTR mapiranja gena NOTCH2NLC na 58,1 Mb povezano područje (Slika 1).Ove ponovljene ekspanzije također su identificirane u svih 40 sporadičnih slučajeva NIID testiranih RP-PCR-om.
Cas-9 posredovano ciljno sekvenciranje na platformi nanopora korišteno je za postizanje veće pokrivenosti čitanja na ponavljanju NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).Ove konsenzusne sekvence dobro su se slagale s prethodnim nalazima o GGC ponovljenim ekspanzijama.Štoviše, ponavljanja {(GGA)n (GGC)n}n identificirana su kao potencijalni genetski marker za fenotip dominantan slabosti (Slika 2).
Slika 1. Ponovljena ekspanzija povezana s bolešću identificirana na eksonu 1 izoformi NOTCH2NLC.
Slika 2. Konsenzusne sekvence ponavljanja NPTCH2NLC u bolesnika s NIID s (*) ili bez fenotipa dominantnog slabosti
NGeni OTCH2NL su geni specifični za ljude, za koje se vjeruje da imaju vitalnu ulogu u evoluciji ljudskog mozga i neurološkim bolestima.Međutim, tri gena povezana s NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB i NOTCH2NLC) s >99,1% identičnosti sekvence nisu razriješena do posljednjeg sklapanja ljudskog genoma.Sekvenciranje bez sinteze i s dugotrajnim čitanjem na platformi nanopora pokazalo je značajne prednosti u rješavanju područja visoke sličnosti i (GGC)n ponavljanja sa 100% GC-bogatim.
GGC ponavljaju ekspanzije u NOTCH2NLC
Tsekvenciranje rankriptoma obrađeno je na 2 zahvaćena i 2 nezahvaćena člana.Normalizirana dubina očitavanja izračunata je na smislenim i antisens lancima uzvodno od prvih egzona NOTCH2NL paraloga.Abnormalni anti-sense transkripti pronađeni su samo u zahvaćenim slučajevima, koji se nalaze na početku ili unutar područja ponovljene ekspanzije (ljubičasti vrhovi u F1-14 i F1-16 na slici 3.).Uz to, identificirana su 54 DEG-a i svi su obogaćeni terminima GO i MPO koji se odnose na neuronske funkcije.
Slika 3. Normalizirana dubina čitanja uzvodno od prvog egzona NOTCH2NLC u nezahvaćenim (gore) i zahvaćenim (dolje) slučajevima.
Tehnologija
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanopore sekvenciranje razlikuje se od ostalih platformi za sekvenciranje po tome što se nukleotidi čitaju izravno bez procesa sinteze DNA.Kako jedan lanac DNA prolazi kroz proteinsku poru nano veličine (nanopora), različiti nukleotidi stvaraju različite ionske struje, koje se mogu uhvatiti i prenijeti u niz baza.ONT platforma za sekvenciranje sama po sebi ne pokazuje očito tehničko ograničenje duljine čitanja DNK.Stoga su Ultra-long reads (ULR) dostupni za sastavljanje genoma visoke kvalitete.Štoviše, ova iznimno duga čitanja, koja su dovoljno duga da prijeđu složene značajke sekvence ili strukturne varijacije, pomažu u prevladavanju ograničenja sekvenciranja kratkog čitanja.
Sekvenciranje nanopora
Identifikacija varijacije strukture (SV).
Ssekvenciranje bez sinteze uvelike je sačuvalo informacije o metilaciji DNA na šabloni.Metilirani A, T, C i G stvaraju različite ionske struje od nemetiliranih, koje platforma može izravno očitati.Sekvenciranje nanopora omogućuje profiliranje cijelog genoma od 5 mC i 6 mA pri rezoluciji jednog nukleotida.
Referenca
Jun Sone, et.al.Sekvenciranje dugotrajnog čitanja identificira ekspanzije ponavljanja GGC u NOTCH2NLC povezane s bolešću intranuklearne inkluzije neurona.Nature Genetics (2019)
Tehnika i vrhunci ima za cilj podijeliti najnoviju uspješnu primjenu različitih tehnologija sekvenciranja visoke propusnosti u raznim istraživačkim arenama, kao i briljantnih ideja u eksperimentalnom dizajnu i rudarenju podataka.
Vrijeme objave: 6. siječnja 2022