TRANSKRIPTOMIKA
priroda
KOMUNIKACIJE
Karakterizacija prijepisa pune duljine mutacije SF3B1 u kroničnoj limfocitnoj leukemiji otkriva smanjenje regulacije zadržanih introna
Cjelovečernji prijepisi|Sekvenciranje nanopora|Analiza alternativnih izoformi
Pozadina
SZa omatske mutacije u faktoru spajanja SF3B1 naširoko se izvješćuje da su povezane s raznim vrstama raka, uključujući kroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), melanom uvee, rak dojke, itd. Osim toga, kratkotrajne transkriptomske studije otkrile su nenormalne obrasce spajanja inducirane mutacijama SF3B1.Međutim, studije o ovim alternativnim obrascima spajanja dugo su bile ograničene na razinu događaja i nedostatak znanja o razini izoforme zbog ograničenja sklopljenih transkripata za kratko čitanje.Ovdje je uvedena platforma za sekvenciranje nanopora za generiranje transkripata pune duljine, što je omogućilo istraživanje AS izoformi.
Eksperimentalni dizajn
Eksperimenti
Grupiranje:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutacija);3. Normalne B-stanice
Strategija sekvenciranja:MinION 2D biblioteka sekvenciranje, PromethION 1D biblioteka sekvenciranje;podaci kratkog čitanja iz istih uzoraka
Platforma za sekvenciranje:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformatička analiza
Rezultati
Aukupno 257 milijuna očitavanja generirano je iz 6 KLL uzoraka i 3 B-stanice.U prosjeku 30,5% ovih čitanja identificirano je kao cjeloviti transkripti.
Falternativna analiza izoforme pune duljine RNA (FLAIR) razvijena je za generiranje skupa izoformi visoke pouzdanosti.FLAIR se može sažeti kao:
Nanopore očitava poravnanje: identificira opću strukturu transkripta na temelju referentnog genoma;
Sispravak spoja plice: ispravite pogreške sekvence (crveno) s mjestom spajanja bilo iz označenih introna, introna iz podataka kratkog čitanja ili oboje;
Collapse: sažmite reprezentativne izoforme na temelju spojnih lanaca (skup prvog prolaza).Odaberite isofrom visoke pouzdanosti na temelju broja podržavajućih čitanja (Prag: 3).
Slika 1. FLAIR analiza za identifikaciju izoformi pune dužine povezanih s mutacijom SF3B1 u KLL-u
FLAIR je identificirao 326 699 spojenih izoformi visoke pouzdanosti, od kojih su 90% nove izoforme.Utvrđeno je da su većina ovih neoznačenih izoformi nove kombinacije poznatih spojeva (142 971), dok su ostale nove izoforme sadržavale ili zadržani intron (21 700) ili novi egzon (3594).
Lon-read sekvence omogućuju identifikaciju mutantnih SF3B1-K700E -promijenjenih mjesta spajanja na razini izoforme.Utvrđeno je da je 35 alternativnih 3'SS i 10 alternativnih 5'SS značajno različito spojeno između SF3B1-K700E i SF3B1-WT.33 od 35 promjena novootkrivene su dugo čitanim sekvencama.U Nanopore podacima, distribucija udaljenosti između SF3B1-K700E-promijenjenih 3'SS-ova do vrhova kanonskih mjesta je oko -20 bp, što se značajno razlikuje od kontrolne distribucije, slično onome što je prijavljeno u sekvencama kratkog čitanja CLL-a.Analizirane su izoforme gena ERGIC3, gdje je pronađena nova izoforma koja sadrži proksimalno mjesto spajanja u većoj količini u SF3B1-K700E.I proksimalni i distalni 3'SS bili su povezani s različitim AS obrascima koji generiraju višestruke izoforme.
Slika 2. Alternativni 3' obrasci spajanja identificirani s podacima o sekvenciranju nanopora
Analiza upotrebe IR događaja dugo je bila ograničena na analizu temeljenu na kratkom čitanju zbog povjerenja u identifikaciju i kvantifikaciju IR.Ekspresija IR izoformi u SF3B1-K700E i SF3B1-WT kvantificirana je na temelju sekvenci nanopora, otkrivajući globalnu nižu regulaciju IR izoformi u SF3B1-K700E.
Slika 4. Intenzitet poljoprivrede i mrežna povezanost u tri poljoprivredna sustava (A i B);Nasumična analiza šuma (C) i odnos između intenziteta poljoprivrede i kolonizacije AMF-a (D)
Slika 3. Događaji zadržavanja introna snažnije su smanjeni u CLL SF3B1-K700E
Tehnologija
Nanopore Long-read sekvenciranje
Nanopore sekvenciranje je tehnologija sekvenciranja električnog signala jedne molekule u stvarnom vremenu.
Ddvolančana DNK ili RNK će se vezati za nanoporozni protein ugrađen u biofilm i odmotati se pod vodstvom motornog proteina.
DNitovi NA/RNA prolaze kroz protein kanala nanopora određenom brzinom pod djelovanjem razlike napona.
Molekule generiraju različite električne signale prema kemijskoj strukturi.
Rotkrivanje sekvenci u cijelom vremenu postiže se pozivanjem baze.
Izvedba sekvenciranja transkriptoma pune duljine
√ Zasićenost podacima
Za postizanje usporedive zasićenosti podacima potrebno je 7 puta manje čitanja.
√ Identifikacija strukture transkripta
Identifikacija različitih strukturnih varijanti s konsenzusnim čitanjem pune duljine svakog transkripta
√ Diferencijalna analiza na razini transkripta - Otkrijte promjene skrivene kratkim čitanjima
Referenca
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Karakterizacija prijepisa pune duljine mutacije SF3B1 u kroničnoj limfocitnoj leukemiji otkriva smanjenu regulaciju zadržanih introna [J].Nature Communications.
Tehnika i vrhunci ima za cilj podijeliti najnoviju uspješnu primjenu različitih tehnologija sekvenciranja visoke propusnosti u raznim istraživačkim arenama, kao i briljantnih ideja u eksperimentalnom dizajnu i rudarenju podataka.
Vrijeme objave: 8. siječnja 2022