Dugo nekodirajuće sekvenciranje-Illumina
Prednosti usluge
● Prednosti usluge
● Stanično i tkivno specifično
● Specifična faza izražava i predstavlja dinamičnu promjenu izražaja
● Precizni obrasci izražavanja vremena i prostora
● Zajednička analiza s podacima mRNA.
● Isporuka rezultata temeljena na BMKCloudu: prilagođeno rudarenje podataka dostupno na platformi.
● Usluge nakon prodaje vrijede 3 mjeseca nakon završetka projekta
Zahtjevi za uzorke i isporuka
| Knjižnica | Platforma | Preporučeni podaci | QC podataka |
| deplecija rRNA | Ilumina PE150 | 10 Gb | Q30≥85% |
| Konc. (ng/μl) | Količina (μg) | Čistoća | Integritet |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Na gelu se vidi ograničena ili nikakva kontaminacija proteinima ili DNK. | Za biljke: RIN≥6,5; Za životinje: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; ograničena ili nikakva osnovna elevacija |
nukleotidi:
Maramica: Težina (suha): ≥1 g
*Za tkivo manje od 5 mg, preporučujemo slanje brzo zamrznutog (u tekućem dušiku) uzorka tkiva.
Stanična suspenzija: Broj stanica = 3×107
*Preporučamo slanje zamrznutog lizata stanica.U slučaju da ta ćelija broji manje od 5×105, preporučuje se brzo zamrzavanje u tekućem dušiku.
Uzorci krvi:
PA×geneBloodRNATube;
6mLTRIzol i 2mL krvi (TRIzol:Krv=3:1)
Preporučena dostava uzoraka
Spremnik: epruveta za centrifugu od 2 ml (ne preporučuje se limena folija)
Označavanje uzorka: Grupa + ponavljanje npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Pošiljka:
1. Suhi led: uzorke je potrebno zapakirati u vrećice i zakopati u suhi led.
2. RNAstable epruvete: RNA uzorci se mogu osušiti u RNA stabilizacijskoj epruveti (npr. RNAstable®) i poslati na sobnoj temperaturi.
Tijek rada usluge
Dizajn eksperimenta
Dostava uzoraka
ekstrakcija RNA
Izgradnja knjižnice
Sekvenciranje
Analiza podataka
Usluge nakon prodaje
Bioinformatika
1.Klasifikacija LncRNA
LncRNA predviđena pomoću četiri gore navedena softvera klasificirana je u 4 kategorije: lincRNA, anti-sense-LncRNA, intronic-LncRNA;osjetilna LncRNA.Klasifikacija LncRNA prikazana je u donjem histogramu.
Klasifikacija LncRNA
2.Cis-ciljani geni analize obogaćivanja DE-lncRNA
ClusterProfiler je korišten u analizi obogaćivanja GO na cis-ciljanim genima različito izražene lncRNA (DE-lncRNA), u smislu bioloških procesa, molekularnih funkcija i staničnih komponenti.Analiza obogaćivanja GO je postupak za identifikaciju DEG-usmjerenih značajno obogaćenih GO termina u usporedbi s cijelim genomom.Obogaćeni izrazi predstavljeni su u histogramu, mjehurićastom grafikonu itd. kao što je prikazano u nastavku.
Cis-ciljani geni analize obogaćivanja DE-lncRNA - Mjehurićasti dijagram
3. Uspoređujući duljinu, broj egzona, ORF i količinu ekspresije mRNA i lncRNA, možemo razumjeti razlike u strukturi, sekvenci i tako dalje među njima, te također provjeriti odgovara li nova lncRNA koju smo mi predvidjeli u skladu s općim karakteristikama.
BMK slučaj
Deregulirani profil ekspresije lncRNA u adenokarcinomima pluća miša s mutacijom KRAS-G12D i nokautom P53
Objavljeno:Časopis za staničnu i molekularnu medicinu，2019
Strategija sekvenciranja
Illumina
Zbirka uzoraka
NONMMUT015812-nockdown KP (shRNA-2) stanice i stanice negativne kontrole (sh-Scr) dobivene su 6. dana specifične virusne infekcije.
Ključni rezultati
Ova studija istražuje aberantno izražene lncRNA u mišjem adenokarcinomu pluća s nokautom P53 i mutacijom KrasG12D.
1,6424 lncRNA bilo je različito izraženo (≥ 2-struka promjena, P <0,05).
2. Među svih 210 lncRNA (FC≥8), ekspresiju 11 lncRNA regulirao je P53, 33 lncRNA KRAS, a 13 lncRNA hipoksija u primarnim KP stanicama.
3.NONMMUT015812, koji je bio izuzetno pojačano reguliran u mišjem adenokarcinomu pluća i negativno reguliran ponovnom ekspresijom P53, otkriven je kako bi se analizirala njegova stanična funkcija.
4. Rušenje NONMMUT015812 pomoću shRNA smanjilo je proliferaciju i migracijske sposobnosti KP stanica.NONMMUT015812 bio je potencijalni onkogen.
 Analiza KEGG puta različito izraženih gena u NONMMUT015812-nokdaun KP stanicama |  Analiza genske ontologije različito izraženih gena u NONMMUT015812-nokdaun KP stanicama |
Referenca
Deregulirani profil ekspresije lncRNA u adenokarcinomima pluća miša s mutacijom KRAS-G12D i nokautom P53 [J].Časopis za staničnu i molekularnu medicinu, 2019., 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
