Sekvenciranje mRNA pune duljine-Nanopore
Prednosti usluge
● Niska pristranost niza
● Otkrivanje cDNA molekula pune duljine
● Manje podataka potrebno za pokrivanje istog broja prijepisa
● Identifikacija višestrukih izoformi po genu
● Kvantifikacija ekspresije na razini izoforme
Specifikacije usluge
| Knjižnica | Platforma | Preporučeni prijenos podataka (Gb) | Kontrola kvalitete |
| cDNA-PCR (Poly-A obogaćen) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/uzorak (ovisno o vrsti) | Omjer pune duljine >70% Prosječna ocjena kvalitete: Q10
|
Bioinformatičke analize
●Obrada sirovih podataka
● Identifikacija prijepisa
● Alternativno spajanje
● Kvantifikacija ekspresije na razini gena i razini izoforme
● Analiza diferencijalnog izraza
● Anotacija i obogaćivanje funkcija (DEG i DET)
Zahtjevi za uzorke i isporuka
Zahtjevi za uzorke:
nukleotidi:
| Konc. (ng/μl) | Količina (μg) | Čistoća | Integritet |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Na gelu se vidi ograničena ili nikakva kontaminacija proteinima ili DNK. | Za biljke: RIN≥7,0; Za životinje: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; ograničena ili nikakva osnovna elevacija |
Maramica: Težina (suha): ≥1 g
*Za tkivo manje od 5 mg, preporučujemo slanje brzo zamrznutog (u tekućem dušiku) uzorka tkiva.
Stanična suspenzija: Broj stanica = 3×106- 1×107
*Preporučamo slanje zamrznutog lizata stanica.U slučaju da ta ćelija broji manje od 5×105, preporučuje se brzo zamrzavanje u tekućem dušiku, što je poželjno za mikro ekstrakciju.
Uzorci krvi: Volumen≥1 ml
Preporučena dostava uzoraka
Spremnik: epruveta za centrifugu od 2 ml (ne preporučuje se limena folija)
Označavanje uzorka: Grupa + ponavljanje npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Pošiljka: 2、Suhi led: Uzorke je potrebno zapakirati u vreće i zakopati u suhi led.
- RNAstable epruvete: RNA uzorci se mogu osušiti u RNA stabilizacijskoj epruveti (npr. RNAstable®) i otpremiti na sobnoj temperaturi.
Tijek rada usluge
nukleotidi:
Dostava uzoraka
Izgradnja knjižnice
Sekvenciranje
Analiza podataka
Usluge nakon prodaje
Tijek rada usluge
Tkivo:
Dizajn eksperimenta
Dostava uzoraka
ekstrakcija RNA
Izgradnja knjižnice
Sekvenciranje
Analiza podataka
Usluge nakon prodaje
1.Analiza diferencijalnog izraza - Vulkan dijagram
Diferencijalna analiza ekspresije može se obraditi na razini gena kako bi se identificirali različito izraženi geni (DEG) i na razini izoforme kako bi se identificirali različito
izraženi transkripti (DET)
2.Toplinska karta hijerarhijskog klasteriranja
3.Identifikacija i klasifikacija alternativnog spajanja
Astalavista može predvidjeti pet tipova alternativnih događaja spajanja.
4.Identifikacija događaja alternativne poli-adenilacije (APA) i motiv na 50 bp uzvodno od poli-A
BMK slučaj
Alternativna identifikacija spajanja i kvantifikacija na razini izoforme sekvenciranjem transkriptoma pune duljine nanopora
Objavljeno:Nature Communications, 2020
Strategija sekvenciranja:
Grupiranje: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutacija K700E);3. Normalne B-stanice
Strategija sekvenciranja: MinION 2D biblioteka sekvenciranja, PromethION 1D biblioteka sekvenciranja;podaci kratkog čitanja iz istih uzoraka
Platforma za sekvenciranje: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Ključni rezultati
1. Identifikacija alternativnog spajanja na razini izoforme
Sekvence dugog čitanja omogućuju identifikaciju mutantnog SF3B1K700E-promijenjena mjesta spajanja na razini izoforme.Utvrđeno je da su 35 alternativnih 3'SS i 10 alternativnih 5'SS značajno različito spojeni između SF3B1K700Ei SF3B1WT.33 od 35 promjena novootkrivene su dugo čitanim sekvencama.
2. Kvantifikacija alternativnog spajanja na razini izoforme
Ekspresija izoformi zadržavanja introna (IR) u SF3B1K700Ei SF3B1WTkvantificirani su na temelju sekvenci nanopora, otkrivajući globalnu nižu regulaciju IR izoformi u SF3B1K700E.
Referenca
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Karakterizacija prijepisa pune duljine mutacije SF3B1 u kroničnoj limfocitnoj leukemiji otkriva smanjenu regulaciju zadržanih introna [J].Nature Communications.
