Proizvodi

Sekvenciranje mRNA pune duljine -PacBio

De novosekvenciranje transkriptoma pune duljine, poznato i kaoDe novoIso-Seq koristi prednosti PacBio sekvencera u duljini čitanja, što omogućuje sekvenciranje cDNA molekula pune duljine bez ikakvih prekida.Time se u potpunosti izbjegavaju greške nastale u koracima sastavljanja prijepisa i konstruiraju unigene skupovi s razlučivošću na razini izoforme.Ovaj unigene set pruža moćne genetske informacije kao "referentni genom" na razini transkriptoma.Dodatno, u kombinaciji s podacima o sekvenciranju sljedeće generacije, ova usluga omogućuje točnu kvantifikaciju ekspresije na razini izoforme.

Platforma: PacBio Sequel II

Knjižnica: knjižnica zvona SMRT

Kontaktirajte nas

Pojedinosti usluge

Demo rezultati

Studija slučaja

Prednosti usluge

● Izravno očitavanje cDNA molekule pune duljine od 3'- kraja do 5'- kraja

● Razlučivost razine izo-forme u strukturi sekvence

● Prijepisi visoke točnosti i integriteta

● Visoko kompatibilan s različitim vrstama

● Veliki kapacitet sekvenciranja s 4 opremljene platforme za sekvenciranje PacBio Sequel II

● Veliko iskustvo s više od 700 projekata RNA sekvenciranja temeljenih na Pacbio-u

● Isporuka rezultata temeljena na BMKCloudu: prilagođeno rudarenje podataka dostupno na platformi.

● Usluge nakon prodaje vrijede 3 mjeseca nakon završetka projekta

Specifikacije usluge

Platforma: PacBio Sequel II

Biblioteka sekvenciranja: knjižnica mRNA obogaćena Poli A

Preporučeni prinos podataka: 20 Gb/uzorak (Ovisno o vrsti)

FLNC（%）： ≥75%

*FLNC: Nekimerni transkripti pune dužine

Bioinformatičke analize

● Obrada sirovih podataka

● Identifikacija prijepisa

● Struktura sekvence

● Kvantifikacija izraza

● Napomena funkcije

Zahtjevi za uzorke i isporuka

Zahtjevi za uzorke:

nukleotidi:

Konc. (ng/μl)

Količina (μg)

Čistoća

Integritet

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Na gelu se vidi ograničena ili nikakva kontaminacija proteinima ili DNK.

Za biljke: RIN≥7,5;

Za životinje: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

ograničena ili nikakva osnovna elevacija

Maramica: Težina (suha):≥1 g
*Za tkivo manje od 5 mg, preporučujemo slanje brzo zamrznutog (u tekućem dušiku) uzorka tkiva.

Suspenzija stanica:Broj stanica = 3×10⁶- 1×10⁷
*Preporučamo slanje zamrznutog lizata stanica.U slučaju da ta ćelija broji manje od 5×10⁵, preporučuje se brzo zamrzavanje u tekućem dušiku, što je poželjno za mikro ekstrakciju.

Uzorci krvi:Volumen≥1 mL

Mikroorganizam:Masa ≥ 1 g

Preporučena dostava uzoraka

Spremnik:
Centrifugalna epruveta od 2 ml (ne preporučuje se limena folija)
Označavanje uzorka: Grupa + ponavljanje npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

Pošiljka:

1. Suhi led: Uzorke je potrebno zapakirati u vrećice i zakopati u suhi led.
2. RNAstable epruvete: RNA uzorci se mogu osušiti u RNA stabilizacijskoj epruveti (npr. RNAstable®) i poslati na sobnoj temperaturi.

Tijek rada usluge

Dizajn eksperimenta

Dostava uzoraka

ekstrakcija RNA

Izgradnja knjižnice

Sekvenciranje

Analiza podataka

Usluge nakon prodaje

Prethodna: Sekvenciranje eukariotske mRNA-Illumina

Sljedeći: Sekvenciranje mRNA pune duljine-Nanopore

1.FLNC raspodjela duljina

Duljina nekimernog čitanja pune duljine (FLNC) označava duljinu cDNA u konstrukciji knjižnice.Distribucija dužine FLNC-a ključni je pokazatelj u ocjeni kvalitete izgradnje knjižnice.

mRNA-FLNC-distribucija duljine-čitanja

FLNC distribucija duljine čitanja

2. Potpuna distribucija duljine regije ORF

Koristimo TransDecoder za predviđanje regija kodiranja proteina i odgovarajućih aminokiselinskih sekvenci za generiranje skupova unigena, koji sadrže potpune neredundantne informacije o transkriptima u svim uzorcima.

mRNA-Kompletna-ORF-distribucija duljine

Potpuna distribucija duljine ORF regije

3. Analiza obogaćenja KEGG puta

Diferencijalno izraženi transkripti (DET) mogu se identificirati usklađivanjem podataka sekvenciranja RNA temeljenog na NGS-u na skupovima transkripata pune duljine generiranim podacima sekvenciranja PacBio.Ti se DET-ovi mogu dalje obraditi za različite funkcionalne analize, npr. analizu obogaćivanja KEGG puta.

mRNA-DEG-KEGG-put-obogaćivanje

DET KEGG staza obogaćivanja - Točkasti prikaz

BMK slučaj

Dinamika razvoja transkriptoma stabljike Populus

Objavljeno: Plant Biotechnology Journal, 2019

Strategija sekvenciranja:
Zbirka uzoraka:regije stabljike: vrh, prvi internodij (IN1), drugi internodij (IN2), treći internodij (IN3), internodij (IN4) i internodij (IN5) iz Nanlin895
NGS-slijed:RNA od 15 pojedinaca skupljena je u jedan biološki uzorak.Tri biološka replika svake točke obrađena su za NGS sekvencu
TGS-slijed:Regije stabljike podijeljene su u tri regije, odnosno apeks, IN1-IN3 i IN4-IN5.Svaka je regija obrađena za PacBio sekvenciranje s četiri vrste biblioteka: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb i 3-10 kb.

Ključni rezultati

1. Identificirano je ukupno 87150 transkripata pune duljine, u kojima je identificirana 2081 nova izoforma i 62058 novih alternativnih spojenih izoformi.
Identificirano je 2.1187 lncRNA i 356 fuzijskih gena.
3. Od primarnog rasta do sekundarnog rasta, identificirano je 15838 različito izraženih transkripata iz 995 različito izraženih gena.U svim DEG-ovima, 1216 bili su faktori transkripcije, od kojih većina još nije objavljena.
Analiza obogaćivanja 4.GO otkrila je važnost stanične diobe i oksidacijsko-redukcijskog procesa u primarnom i sekundarnom rastu.