METAXENOMICA
Xenomas bacterianos completos e pechados de microbiomas mediante a secuenciación de nanoporos
Secuenciación de nanoporos |Metaxenómica |MAGs |Circularización do xenoma bacteriano |Microbiota intestinal
Destacados
1. Neste estudo presentouse un método novedoso para extraer fragmentos longos de ADN, que logrou a extracción de microgramos de ADN HMW puro axeitado para a secuenciación de longa lectura a partir de 300 mg de feces.
2. Neste estudo introduciuse un fluxo de traballo de montaxe, Lathe, onde os MAG foron montados mediante lecturas longas e corrixidos mediante lecturas curtas.
3.O torno foi avaliado por mestura simulada.7 de cada 12 bacterias ensamblaron con éxito en contigs únicos e 3 ensamblaronse en catro ou menos contigs.
4.Aplicouse aínda máis o torno ás mostras de feces, que xeraron 20 xenomas circularizados, incluíndo Prevotella copri e o candidato Cibiobacter sp., que eran coñecidos por ser ricos en elementos xenéticos móbiles.
Logro Principal
Protocolo de extracción de ADN HWM
Os estudos metaxenómicos do intestino baseados na secuenciación de lecturas longas sufriron durante moito tempo a dureza na extracción de ADN de alto peso molecular (HMW) das feces.Neste estudo, introduciuse un protocolo de extracción baseado en encimas para evitar un corte extensivo por bateo de contas nos métodos tradicionais.Como se mostra na seguinte figura, as mostras foron tratadas en primeiro lugar cun cóctel de encimas, incluíndo encima lítico, MetaPolyzyme, etc. para degradar as paredes celulares.O ADN liberado foi extraído polo sistema fenol-cloroformo, seguido da dixestión da Proteinase K e da RNase A, a purificación en columna e a selección do tamaño SPRI.Este método conseguiu obter microgramos de ADN HMW a partir de 300 m de feces, o que cumpre os requisitos de secuenciación de lectura longa tanto en calidade como en cantidade.
Figura 1. Esquema de extracción de ADN HWM
Esquema de fluxo de torno
Como se describe na seguinte figura, Lathe contén o proceso existente de proceso de chamada base en bruto usando Guppy.Flye e Canu producen dous conxuntos de lectura longa por separado seguidos da detección e eliminación de montaxes incorrectas.Os dous subconxuntos únense con quickmerge.Despois da fusión, compróbase a circularización dos grandes conxuntos a nivel de megabase.Posteriormente, o perfeccionamento do consenso sobre estas asembleas procédese con lecturas curtas.Os xenomas bacterianos ensamblados finais son procesados para a detección e eliminación de mal ensamblaxe final.
Figura 2. Esquema de fluxo da montaxe do Torno
Avaliación do Torno con mestura de bacterias simuladas
Empregouse unha mestura estándar de 12 especies ATCC que comprende bacterias Gram positivas e Gram negativas para avaliar o rendemento da plataforma de secuenciación de nanoporos e do torno na montaxe MAG.A plataforma nanopore xerou un total de 30,3 Gb de datos con N50 de 5,9 kb.O torno mellorou en gran medida a montaxe N50 de 1,6 a 4 veces en comparación con outras ferramentas de montaxe de lectura longa e de 2 a 9 veces en comparación coas ferramentas de montaxe híbridas.De 12 xenomas bacterianos, sete foron ensamblados en contigs únicos (Figura 3. Circos con punto negro).Tres máis foron ensamblados en catro ou menos contigs, nos que o conxunto máis incompleto contiña o 83% do xenoma nun só contig.
Figura 3. Conxuntos xenómicos nunha mestura bacteriana definida de 12 especies
Aplicación de Torno en mostras de feces
Este método aplicouse aínda máis a mostras de feces humanas para comparar a identificación do organismo e a contigüidade da montaxe cos métodos existentes, a análise baseada na nube de lectura e en lectura curta.A partir das tres mostras implicadas, a nova extracción baseada en enzimas deu polo menos 1 μg por cada 300 mg de masa de entrada.A secuenciación de nanoporos deste ADN HMW xerou lecturas longas con N50 de 4,7 kb, 3,0 kb e 3,0 kb respectivamente.En particular, o método actual mostrou un gran potencial na detección microbiana en comparación cos métodos existentes.Aquí mostrouse unha diversidade alfa a nivel de especie relativamente maior en comparación coa lectura curta e a nube de lectura.Ademais, todos os xéneros procedentes da análise de lectura curta, incluso os organismos Gram positivos normalmente resistentes á lise, foron recuperados por este método.
Figura 4. Diversidade alfa e compoñentes taxonómicos determinados por Nanopore, métodos de lectura curta e de lectura en nube
O torno produciu un conxunto N50 moito máis longo que o conxunto de lectura curta e de lectura en nube, a pesar dunha entrada de datos en bruto de tres a seis veces menor.Os borradores dos xenomas foron producidos mediante contig binning, no que os borradores clasificáronse en "de alta calidade" ou "parciais" en función da integridade, a contaminación, os xenes do núcleo dunha soa copia, etc. para lectura curta e lectura en nube.
Figura 5. Contigüidade de montaxe por organismo de cada método
Ademais, o enfoque de ensamblaxe actual é capaz de producir xenomas circulares pechados.Nas mostras de feces reuníronse oito xenomas dun só contig de alta calidade e cinco destes lograron unha circularización precisa.O enfoque de lectura longa tamén mostrou unha capacidade impresionante para resolver elementos repetitivos nos xenomas.CircularizadoP. copriO xenoma foi xerado por este enfoque, que se sabe que contén un alto grao de repetición de secuencias.A mellor montaxe deste xenoma por lectura curta e lectura en nube nunca superou N50 de 130 kb, mesmo cunha profundidade de cobertura de 4800X.Estes elementos de gran número de copias resolvéronse por completo mediante un enfoque de lectura longa, que adoita atoparse nos puntos de ruptura de conxuntos de lectura curta ou de lectura en nube.Neste estudo informouse doutro xenoma pechado, que se cría que era un membro do descrito recentementeCibiobacterclado.Neste conxunto pechado identificáronse cinco fagos putativos, que van de 8,5 a 65,9 kb.
Figura 6. Diagrama de Circos dos xenomas pechados de P.copri e Cibiobacter sp.
Referencia
Moss, EL, Maghini, DG e Bhatt, AS (2020).Xenomas bacterianos completos e pechados de microbiomas mediante a secuenciación de nanoporos.Biotecnoloxía da natureza,38(6), 701-707.
Tecnoloxía e aspectos destacados ten como obxectivo compartir a aplicación exitosa máis recente de diferentes tecnoloxías de secuenciación de alto rendemento en varios ámbitos de investigación, así como ideas brillantes en deseño experimental e minería de datos.
Hora de publicación: Xaneiro-07-2022