RESECUCIÓN DO XENOMA TODO
O seguimento xenómico do SARS-CoV-2 descobre unha variante de deleción de Nsp1 que modula a resposta do interferón tipo I
Nanopore |Ilumina |Resecuenciación do xenoma completo |metaxenómica |ARN-Seq |Sanger
Biomarker Technologies proporcionou apoio técnico sobre a secuenciación de mostras neste estudo.
Destacados
1. A secuenciación do xenoma do SARS-CoV-2 e a análise filognética identifican 35 mutacións recorrentes, incluíndo 31 SNP e 4 Indels.
2.A asociación con 117 fenotipos clínicos revela potencialmente
mutacións importantes.
∆500-532 na rexión codificante Nsp1 correlaciona con menor número de virus
3.carga e IFN-β sérico.
4. Os illados virais con mutación ∆500-532 inducen un menor IFN-I
resposta nas células infectadas.
Deseño Experimental
Logros
1. Vixilancia epidemiolóxica e xenómica da COVID-19
Os datos clínicos recompiláronse na provincia de Sichuan, China durante o período do brote do 22 de xaneiro de 2020 ao 20 de febreiro de 2020. Un total de 538 casos de COVID-19 foron confirmados mediante probas de qPCR en Sichuan, o 28,8% dos cales eran da provincia. capital.Os casos confirmados en Sichuan aumentaron exponencialmente, alcanzando un máximo o 30 de xaneiro.Ademais, os datos apoiaron que o distanciamento social pode ser un factor clave para evitar a propagación do virus.
Figura 1. Estudo epidemiolóxico de COVID-19 na provincia de Sichuan, China
2. Construción do xenoma e identificación de variantes do SARS-CoV-2
Coa amplificación por PCR múltiple seguida da secuenciación de nanoporos, xeráronse un total de 310 xenomas case completos ou parcialmente completos de 248 pacientes con aprox.80% dos xenomas cubertos por 10 lecturas (Profundidade media: 0,39 M lecturas por mostra).
Figura 2. Frecuencia de cada variante na cohorte de Sichuan
Identificáronse un total de 104 SNP e 18 Indels a partir dos xenomas do SARS-CoV-2, nos que se identificaron 31 SNP e 4 Indels como variantes xenéticas recorrentes.Comparándoas con 169 mostras de Wuhan e con 81.391 secuencias do xenoma publich de alta calidade en GISAID, 29 das 35 variantes atopadas presentáronse noutros continentes.En particular, catro variantes, incluíndo ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 e T13243C, só se atoparon presentes en Sichuan e Wuhan e ausentes nos datos de GISAID, o que indica que é moi probable que estas variantes fosen melloradas desde Wuhan, que cumpren os requisitos rexistros de viaxe dos pacientes.
A análise evolutiva co método de máxima verosimilitud (ML) e enfoques de reloxo molecular bayesiano procesouse en 88 novos virus de Sichuan e en 250 xenomas curados doutras rexións.Atopáronse xenomas con ∆500-532 (delecións na rexión codificante Nsp1) distribuídos escasamente na árbore filoxenética.A análise de haplotipos en variantes de Nsp1 identificou 5 delas de varias cidades.Estes resultados suxiren que o ∆500-532 ocorreu en varias cidades e podería ser importado varias veces desde Wuhan.
Figura 2. Variantes xenéticas recorrentes e análise filoxenética nos xenomas do SARS-CoV-2
3. Asociación de variantes xenéticas recorrentes con implicacións clínicas
Asociáronse 117 fenotipos clínicos coa gravidade da COVID-19, onde 19 fenotipos relacionados coa gravidade clasificáronse en trazos graves e non graves.A relación entre estes trazos e 35 variantes xenéticas recorrentes viualizouse nun mapa de calor bi-cluster.Unha análise de enriquecemento clasificado tipo GSEA mostrou que ∆500-532 está correlacionado negativamente coa VSG, o IFN-β sérico e os recontos de células T CD3+CD8+ no sangue.Ademais, as probas de qPCR mostraron que os pacientes infectados con virus que albergaban ∆500-532 tiñan o valor Ct máis alto, é dicir, a menor carga viral.
Figura 3. Asociacións de 35 variantes xenéticas recorrentes con fenotipos clínicos
4. Validación de fenotipos clínicos asociados á mutación viral
Para comprender os efectos de ∆500-532 nas funcións de Nsp1, transfectáronse células HEK239T con plásmidos que expresan formas de lonxitude completa, WT Nsp1 e mutantes con delecións.Os perfís de transcriptoma de cada célula HEK239T tratada foron procesados para a análise de PCA, mostrando que os mutantes de deleción se agrupaban relativamente máis preto e eran significativamente diferentes de WT Nsp1.Os xenes que estaban significativamente regulados nos mutantes estaban enriquecidos principalmente en "proceso biosintético/metabólico de péptidos", "bioxénese do complexo de ribonucleoproteínas", "diriximento de proteínas á membrana/ER", etc. Ademais, dúas delecións mostraron un patrón de expresión distinto do WT.
Figura 4. Análise do transcriptoma en células HEK239T transfectadas por WT Nsp1 e que con delecións
Os efectos das delecións na resposta do IFN-1 tamén se probaron nun estudo sobreexpresado.Demostrouse que todas as delecións probadas reducen a resposta de IFN-1 nas células HEK239T e A549 transfectadas tanto a nivel de transcriptoma como de proteína.Curiosamente, os xenes significativamente regulados á baixa nas delecións enriquecéronse en "resposta de defensa ao virus", "replicación do xenoma viral", "regulación da transcrición pola ARN polimerase II" e "resposta ao interferón tipo I".
Figura 5. Regulación á baixa das vías de sinalización do interferón no mutante ∆500-532
Neste estudo, o impacto destas eliminacións no virus foi confirmado aínda máis por estudos de infección viral.Illáronse virus con certos mutantes a partir de mostras clínicas e infectáronse con células Calu-3.Os resultados detallados sobre o estudo da infección viral pódense ler no artigo.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referencia
Lin J, Tang C, Wei H, et al.O seguimento xenómico do SARS-CoV-2 descobre unha variante de deleción de Nsp1 que modula a resposta do interferón tipo I [J].Célula hóspede e microbio, 2021.
Novidades e Destacados ten como obxectivo compartir os últimos casos exitosos con Biomarker Technologies, capturando novos logros científicos, así como técnicas destacadas aplicadas durante o estudo.
Hora de publicación: 06-xan-2022