METAGENOMICS
Genomes bactaraidh coileanta, dùinte bho mhicrobiomain a’ cleachdadh sreath nanopore
Seicheamhachadh Nanopore |Metagenomics |MAGs |Cearcallachadh genome bacterial |Gut microbiota
Prìomh thachartasan
1. Chaidh dòigh ùr-nodha airson pìosan fada de DNA a thoirt a-mach a thaisbeanadh anns an sgrùdadh seo, a thug gu buil microgram de DNA fìor-ghlan, HMW a bha freagarrach airson seicheamhan fada-leughaidh bho 300 mg de stòl
2.Chaidh sruth-obrach cruinneachaidh, Lathe, a thoirt a-steach san sgrùdadh seo, far an deach MAGn a chur ri chèile le leughaidhean fada agus air an ceartachadh le leughaidhean goirid.
Chaidh 3.Lathe a mheasadh le measgachadh meallta.Chaidh 7 a-mach à 12 bacteria a chruinneachadh gu soirbheachail ann an contigs singilte agus chaidh 3 a chruinneachadh ann an ceithir contigs no nas lugha.
Chaidh 4.Lathe a chuir an sàs tuilleadh ann an sampallan stòl, a chruthaich 20 genomes cruinn, a’ gabhail a-steach Prevotella copri agus an tagraiche Cibiobacter sp., a bha ainmeil airson a bhith beairteach ann an eileamaidean ginteil gluasadach.
Prìomh Choileanadh
Pròtacal às-tharraing airson HWM DNA
Tha sgrùdaidhean fada-leughaidh stèidhichte air gut metagenomic air a bhith air fulang o chionn fhada le cruas ann a bhith a’ toirt a-mach DNA le cuideam mòr moileciuil (HMW) bho stòl.Anns an sgrùdadh seo, chaidh protocol às-tharraing stèidhichte air enzyme a thoirt a-steach gus rùsgadh farsaing a sheachnadh le bhith a ’bualadh grìogagan ann an dòighean traidiseanta.Mar a chithear san fhigear a leanas, chaidh na sampallan a làimhseachadh an toiseach le cocktail de enzymes, a’ toirt a-steach enzyme lytic, MetaPolyzyme, msaa gus ballachan cealla a lughdachadh.Chaidh DNA a chaidh a leigeil ma sgaoil a thoirt a-mach le siostam Phenol-chloroform, air a leantainn le cnàmhadh Proteinase K agus RNase A, glanadh stèidhichte air colbh agus taghadh meud SPRI.Chaidh aig an dòigh seo air micrograman de HMW DNA a thoirt a-mach à 300 m de stòl, a choileanas riatanasan sreath fada-leughaidh a thaobh càileachd agus meud.
Figear 1. Sgeama tarraing às DNA HWM
Sgeama sruth de Lathe
Mar a chaidh a mhìneachadh anns an fhigear a leanas, tha Lathe a’ toirt a-steach pròiseas pròiseas call bunaiteach amh a’ cleachdadh Guppy.Bidh Flye agus Canu an uairsin a’ dèanamh dà cho-chruinneachadh le leughadh fada air leth agus an uairsin lorgar agus toirt air falbh mì-cho-chruinneachadh.Tha an dà fho-cho-chruinneachadh air an aonachadh le quickmerge.Nuair a thèid an aonachadh, thèid co-chruinneachaidhean mòra aig ìre megabase an uairsin a sgrùdadh airson cuairteachadh.Às deidh sin, tha ùrachadh co-aontachd air na co-chruinneachaidhean sin air a phròiseasadh le leughaidhean goirid.Bithear a’ giullachd genomes bacteriach cruinnichte deireannach airson a bhith a’ lorg agus a’ toirt air falbh mì-cho-chruinneachadh deireannach.
Figear 2. Sgeama sruthadh co-chruinneachadh Lathe
Luachadh air Lathe le measgachadh bacteria meallta
Chaidh measgachadh àbhaisteach ATCC 12-gnè anns a bheil an dà chuid bacteria Gram-positive agus Gram-negative fhastadh gus coileanadh àrd-ùrlar sreath nanopore agus Lathe ann an co-chruinneachadh MAG a mheasadh.Chaidh dàta 30.3 Gb gu h-iomlan a chruthachadh le àrd-ùrlar nanopore le N50 de 5.9 kb.Leasaich deil co-chruinneachadh N50 gu 1.6 gu 4-fhillte gu ìre mhòr an coimeas ri innealan cruinneachaidh eile le leughadh fada agus 2 gu 9-fhillte an coimeas ri innealan cruinneachaidh tar-chinealach.A-mach à 12 genomes bactaraidh, chaidh seachdnar a chur ri chèile ann an contigs singilte (Figear 3. Circos le dot dubh).Chaidh trì eile a chruinneachadh ann an ceithir contigs no nas lugha, anns an robh 83% den genoma ann an aon contig anns a’ cho-chruinneachadh as neo-choileanta.
Figear 3. Co-chruinneachaidhean genome ann am measgachadh bacterial de ghnè 12 comharraichte
Cleachdadh Lathe ann an sampallan stòl
Chaidh an dòigh seo a chuir an sàs nas motha ann an sampallan stòl daonna gus coimeas a dhèanamh eadar comharrachadh fàs-bheairt agus co-chòrdadh cruinneachaidh ri modhan a th’ ann mar-thà, leughadh-sgòthan agus mion-sgrùdadh stèidhichte air leughadh goirid.Bho na trì sampaill a bha an sàs, thug an às-tharraing ùr stèidhichte air enzyme co-dhiù 1 μg gach 300 mg de tomad cuir a-steach.Chruthaich sreath nanopore den DNA HMW sin leughaidhean fada le N50 de 4.7 kb, 3.0kb agus 3.0kb fa leth.Gu sònraichte, sheall an dòigh a th’ ann an-dràsta comas mòr ann an lorg microbial an taca ris na dòighean a th’ ann.Bha iomadachd alpha ìre gnè gu ìre nas àirde air a shealltainn an seo an taca ri leughadh goirid agus leughadh-sgòth.A bharrachd air an sin, chaidh a h-uile ginealach bho sgrùdadh goirid, eadhon fàs-bheairtean Gram-positive a tha an aghaidh lysis, fhaighinn air ais leis an dòigh seo.
Figear 4. Iomadachd Alpha agus co-phàirtean taxanomic air a dhearbhadh le dòighean Nanopore, leughadh goirid agus leughadh-sgòth
Thug deil toradh làn-cho-chruinneachadh N50 fada nas fhaide na co-chruinneachadh leughadh goirid agus leughadh-sgòth, a dh’ aindeoin cuir a-steach trì gu sia-fhillte nas ìsle de dhàta amh.Chaidh dreachd genomes a thoirt gu buil le contig binning, anns an robh na dreachan air an seòrsachadh mar “àrd-chàileachd” no “pàirteach” stèidhichte air iomlanachd, truailleadh, ginean bunaiteach aon-lethbhreac, msaa. gu leughadh goirid agus leughaidh-neul.
Figear 5. Per-organism co-chruinneachadh contiguity de gach dòigh
A bharrachd air an sin, tha an dòigh cruinneachaidh gnàthach comasach air genomes dùinte, cearcallach a thoirt gu buil.Anns na sampallan stòl, chaidh ochd genomes aon-contig àrd-inbhe a chruinneachadh agus fhuair còig dhiubh sin cuairteachadh cruinn.Sheall dòigh-obrach le leughadh fada cuideachd comas iongantach ann a bhith a’ fuasgladh eileamaidean ath-aithris ann an genomes.Air a chuairteachadhP. copriChaidh genome a chruthachadh leis an dòigh-obrach seo, a tha aithnichte gu bheil ìre àrd de ath-aithris sreath ann.Cha deach an co-chruinneachadh as fheàrr den genoma seo le leughadh goirid agus leughadh-sgòth a-riamh thairis air N50 de 130 kb, eadhon le doimhneachd còmhdaich de 4800X.Chaidh na h-eileamaidean àireamh leth-bhreac àrd seo fhuasgladh gu h-iomlan le dòigh-obrach fad-leughaidh, a lorgadh gu tric aig amannan briseadh co-chruinneachaidhean leughaidh goirid no leughadh-sgòth.Chaidh aithris air genoma dùinte eile san sgrùdadh seo, a bhathas a’ creidsinn a bha na bhall de a chaidh a mhìneachadh o chionn ghoiridCibiobactercladh.Chaidh còig phage putative a chomharrachadh anns a’ cho-chruinneachadh dùinte seo, eadar 8.5 agus 65.9 kb.
Figear 6. Diagram circos de genomes dùinte de P.copri agus Cibiobacter sp.
Iomradh
Còinneach, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Genomes bactaraidh coileanta, dùinte bho mhicrobiomain a’ cleachdadh sreath nanopore.Bith-theicneòlas nàdair,38(6), 701-707.
Teicneòlas agus àrd-amasan ag amas air a bhith a’ roinneadh an cleachdadh soirbheachail as ùire de dhiofar theicneòlasan sreathachaidh àrd-threabhadh ann an diofar raointean rannsachaidh a bharrachd air beachdan sgoinneil ann an dealbhadh deuchainneach agus mèinneadh dàta.
Ùine puist: Jan-07-2022