Seicheamh mRNA lánfhad -PacBio
Buntáistí Seirbhíse
● Léamh díreach amach an mhóilín cDNA lánfhad ó 3'- deireadh go deireadh 5'-
● Taifeach leibhéal an iso-fhoirm i struchtúr seichimh
● Athscríbhinní le cruinneas agus sláine ard
● An-chomhoiriúnach do speicis vaiours
● Cumas seicheamhaithe mór le 4 ardán seicheamhaithe PacBio Sequel II feistithe
● An-taithí acu le breis is 700 tionscadal seicheamhaithe RNA bunaithe ar Pacbio-bhunaithe
● Seachadadh torthaí bunaithe ar BMKCloud: Mianadóireacht sonraí saincheaptha ar fáil ar an ardán.
● Seirbhísí iar-díola bailí ar feadh 3 mhí ar chríochnú an tionscadail
Sonraíochtaí Seirbhíse
Ardán: PacBio Sequel II
Leabharlann seicheamhaithe: Leabharlann mRNA polai-A- saibhrithe
Toradh sonraí molta: 20 Gb/sampla (Ag brath ar speiceas)
FLNC (%）: ≥75%
*FLNC: Trascipéid neamhchiméireacha lánfhad
Anailísí bithfhaisnéisíochta
● Próiseáil sonraí amh
● Aithint tras-scríbhinne
● Struchtúr seicheamhach
● Cainníochtú Slonn
● Anótáil Feidhme
Riachtanais Samplacha agus Seachadadh
Riachtanais Shamplacha:
Núicléatídí:
| Conc.(ng/μl) | Méid (μg) | Íonachta | Ionracas |
| ≥ 120 | ≥ 0.6 | OD260/280=1.7-2.5 OD260/230=0.5-2.5 Éilliú próitéine nó DNA teoranta nó gan aon a thaispeáint ar fhoirmiú. | Do phlandaí: RIN≥7.5; I gcás ainmhithe: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; ingearchló bunlíne teoranta nó gan aon |
Fíochán: Meáchan(tirim):≥1 g
* I gcás fíocháin níos lú ná 5 mg, molaimid sampla fíocháin reoite (i nítrigin leachtach) a sheoladh.
Fionraí cille:Comhaireamh cille = 3×106- 1×107
* Molaimid lysate cille reoite a longáil.Sa chás go n-áireofar an chill sin níos lú ná 5×105, moltar flash reoite i nítrigine leachtach, rud is fearr le haghaidh micrea-eastóscadh.
Samplaí fola:Toirt ≥1 mL
Miocrorgánach:Mais ≥ 1 g
Seachadadh Samplach Molta
Coimeádán:
Feadán lártheifneoir 2 ml (ní mholtar scragall stáin)
Lipéadú samplach: Grúpa+ a mhacasamhlú m.sh. A1, A2, A3;B1, B2, B3...
Loingsiú:
1. Oighear tirim: Ní mór samplaí a phacáil i málaí agus a chur faoi oighear tirim.
2. Feadáin RNAstable: Is féidir samplaí RNA a thriomú i bhfeadán cobhsaíochta RNA (m.sh. RNAstable®) agus a sheoladh i dteocht an tseomra.
Sreabhadh Oibre Seirbhíse
Dearadh turgnaimh
Seachadadh samplach
eastóscadh RNA
Tógáil leabharlainne
Seicheamhú
Anailís sonraí
Seirbhísí iar-díola
Dáileadh fad 1.FLNC
Léiríonn fad an léite neamhchiméireach lánfhad (FLNC) fad an cDNA i dtógáil na leabharlainne.Is táscaire ríthábhachtach é dáileadh faid FLNC maidir le cáilíocht na tógála leabharlainne a mheas.
Dáileadh fad léite FLNC
Dáileadh fad réigiúin 2.Complete ORF
Bainimid úsáid as TransDecoder chun réigiúin códaithe próitéine agus seichimh aimínaigéad comhfhreagracha a thuar chun tacair unigéinéin a ghiniúint, ina bhfuil faisnéis tras-scríbhinní iomlán neamh-iomarcach i ngach sampla.
Dáileadh fad réigiúin ORF i gcrích
Anailís saibhrithe cosán 3.KEGG
Is féidir tras-scríbhinní arna gcur in iúl go difreálach (DETanna) a shainaithint trí shonraí seicheamhaithe RNA atá bunaithe ar NGS a ailíniú ar thacair tras-scríbhinní lánfhad ginte ag sonraí seicheamhaithe PacBio.Is féidir na DETanna seo a phróiseáil tuilleadh le haghaidh anailíse feidhmiúcháin éagsúla, m.sh. anailís saibhrithe conair KEGG.
Saibhriú cosán DET KEGG -Plota ponc
Cás BMK
An dinimic forbraíochta an Populus gas transcriptome....
Foilsithe: Iris Biteicneolaíochta Plandaí, 2019
Straitéis seicheamhaithe:
Bailiúchán samplaí:Réigiúin ghas: apex, an chéad idirnóid (IN1), an dara idirnóid (IN2), an tríú idirnóid (IN3), idirnóid (IN4) agus idirnóid (IN5) ó Nanlin895
seicheamh NGS:Comhthiomsaíodh RNA de 15 duine mar shampla bitheolaíoch amháin.Próiseáladh trí mhacasamhlú bhitheolaíocha de gach pointe le haghaidh seicheamh NGS
seicheamh TGS:Roinneadh réigiúin gas i dtrí réigiún, ie apex, IN1-IN3 agus IN4-IN5.Próiseáladh gach réigiún le haghaidh seicheamhú PacBio le ceithre chineál leabharlann: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb agus 3-10 kb.
Príomhthorthaí
1. Sainaithníodh 87150 tras-scríbhinn lánfhad, inar aithníodh 2081 isfhoirm úrscéalta agus 62058 isfhoirmeach splice malartach úrnua.
Aithníodh 2.1187 lncRNA agus 356 géinte comhleá.
3. Ó fhás príomhúil go fás tánaisteach, aithníodh 15838 tras-scríbhinní a cuireadh in iúl go difreálach ó 995 géinte a cuireadh in iúl go difreálach.I ngach DEG, ba fhachtóirí trascríobh iad 1216, agus níor tuairiscíodh an chuid is mó díobh fós.
Léirigh anailís saibhrithe 4.GO tábhacht a bhaineann le rannán cille agus próiseas laghdaithe ocsaídiúcháin i bhfás bunscoile agus meánscoile.
Imeachtaí splicing malartacha agus isoforms éagsúla
Anailís WGCNA ar fhachtóirí trascríobh
Tagairt
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.An dinimic forbraíochta an Populus gas transcriptome....Biteicneolaíocht Plandaí J. 2019; 17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
