METAGENOMIKA
Folsleine, sletten baktearjele genomen fan mikrobiomen mei nanopore-sekwinsje
Nanopore Sequencing |Metagenomics |MAGs |Bakteriële genome circularization |Darm mikrobiota
Hichtepunten
1.In nije metoade om lange fragminten fan DNA te ekstrahearjen waard presintearre yn dizze stúdzje, dy't ekstraksje fan mikrogram fan suver, HMW-DNA berikte, geskikt foar langlêzen sekwinsje fan 300 mg kruk
2.In gearkomste workflow, Lathe, waard yntrodusearre yn dizze stúdzje, dêr't MAGs waarden gearstald troch lange lêzen en korrizjearre troch koarte-lêzen.
3.Lathe waard evaluearre troch mock mixure.7 fan de 12 baktearjes waarden mei súkses gearstald yn inkele contigs en 3 waarden gearstald yn fjouwer of minder contigs.
4.Lathe waard fierder tapast op stoolmonsters, dy't generearre 20 circularized genomes, ynklusyf Prevotella copri en kandidaat Cibiobacter sp., dy't bekend wiene om ryk te wêzen oan mobile genetyske eleminten.
Main Achievement
Ekstraksjeprotokol foar HWM DNA
Langlêzen sequencing basearre darmmetagenomyske stúdzjes hawwe lang lêst fan hurdens by it ekstrahearjen fan heech molekulêr gewicht (HMW) DNA út kruk.Yn dizze stúdzje waard in enzyme-basearre ekstraksjeprotokol yntrodusearre om wiidweidich skjirre te foarkommen troch kralen te slaan yn tradisjonele metoaden.Lykas werjûn yn 'e folgjende figuer, waarden de samples earst behannele mei in cocktail fan enzymen, ynklusyf lytyske enzyme, MetaPolyzyme, ensfh.Released DNA waard ekstrahearre troch Phenol-chloroform systeem, folge troch Proteinase K en RNase A spiisfertarring, kolom-basearre suvering en SPRI grutte seleksje.Dizze metoade slagge om mikrogrammen fan HMW-DNA op te leverjen út 300 m stoel, dy't foldocht oan easken foar lange-lêzen sequencing yn termen fan sawol kwaliteit as kwantiteit.
figuer 1. HWM DNA ekstraksje skema
Scheme flow fan Lathe
Lykas beskreaun yn de folgjende figuer, befettet Lathe besteande proses fan rau basecalling proses mei help fan Guppy.Twa lange-lêzen gearkomsten wurde dan produsearre troch Flye en Canu apart folge troch mis-assemblage opspoaren en ferwidering.De twa sub-assemblies wurde gearfoege mei quickmerge.By gearfoeging wurde grutte gearkomsten op megabasenivo dan kontrolearre op sirkularisaasje.Ferfolgens wurdt konsensusferfining oer dizze gearkomsten ferwurke mei koarte lêzings.Finale gearstalde baktearjele genomen wurde ferwurke foar definitive deteksje en ferwidering fan mis-assemblage.
figuer 2. Scheme flow fan Lathe gearkomste
Evaluaasje fan Lathe mei mock baktearje mingsel
In standert ATCC 12-soarten mingsel besteande út sawol Gram-positive en Gram-negative baktearjes waard ynset om te evaluearjen de prestaasjes fan nanopore sequencing platfoarm en Lathe yn MAG gearkomste.In totaal fan 30.3 Gb gegevens waard generearre troch nanopore platfoarm mei N50 fan 5.9 kb.Draaibank foar in grut part ferbettere gearkomste N50 oan 1,6 oan 4-fold yn ferliking mei oare lange-lêzen assembly ark en 2 oan 9-fold ferlike mei hybride assembly ark.Fan 12 baktearjele genomen waarden sân gearstald yn inkele contigs (figuer 3. Circos mei swarte stip).Trije mear waarden gearstald yn fjouwer of minder contigs, wêrby't de meast ûnfolsleine gearstalling 83% fan it genoom yn ien kontig befette.
figuer 3. Genome gearkomsten yn in definiearre 12-soarten baktearjele mingsel
Tapassing fan lathe yn stoelmonsters
Dizze metoade waard fierder tapast op minsklike stoelmonsters om de identifikaasje en gearstalling fan organismen te fergelykjen mei besteande metoaden, lêzen-wolk en koarte-lêzen basearre analyse.Fan 'e trije belutsen samples levere de nije enzyme-basearre ekstraksje op syn minst 1 μg per 300 mg ynfiermassa.Nanopore-sekwinsje fan dizze HMW-DNA generearre lange lêzen mei N50 fan respektivelik 4.7 kb, 3.0kb en 3.0kb.Opmerklik toande de hjoeddeistige metoade in grut potensjeel yn mikrobiële deteksje yn ferliking mei besteande metoaden.Relatyf heger soarte-nivo alfa ferskaat waard hjir te sjen yn ferliking mei koarte-lêzen en lêzen-wolk.Boppedat waarden alle genera út koarte-lêzen analyse, sels typysk lysis-resistinte Gram-positive organismen, weromfûn troch dizze metoade.
Figure 4. Alpha-ferskaat en taksonomyske komponinten bepaald troch Nanopore, koarte-lêzen en lêzen-wolkmetoaden
Draaibank levere folle langer hiele-gearkomste N50 as koarte-lêzen en lêzen-wolk gearkomste, nettsjinsteande in trije- oant seis kear legere ynfier fan rauwe gegevens.Untwerp genomes waarden produsearre troch contig binning, wêryn de ûntwerpen waarden yndield yn "hege kwaliteit" of "diel" basearre op folsleinens, fersmoarging, single-copy kearngenen, ensfh te koartlêzen en lêzen-wolk.
figuer 5. Per-organisme gearkomste contiguity fan eltse metoade
Boppedat is de hjoeddeistige assemblage-oanpak yn steat om sletten, sirkulêre genomen te leverjen.Yn 'e stoelmonsters waarden acht heechweardige, single-contig genomes gearstald en fiif fan dizze berikten percise sirkularisaasje.Langlêzen oanpak toande ek yndrukwekkende kapasiteit by it oplossen fan repetitive eleminten yn genomen.CircularizedP. coprigenome waard generearre troch dizze oanpak, dy't bekend is om hege graad fan sekwinsje werhelling te befetsjen.De bêste gearstalling fan dit genome troch koarte-lêzen en lêzen-wolk nea boppe N50 fan 130 kb, sels mei dekking djipte fan 4800X.Dizze eleminten mei hege kopynûmers waarden folslein oplost troch lange-lêzen oanpak, dy't faak fûn wurde op brekpunten fan gearkomsten mei koarte-lêzen of lêzen-wolk.In oare sletten genome waard rapportearre yn dizze stúdzje, dat waard leaud te wêzen lid fan koartlyn beskreaunCibiobakterclade.Fiif putative fagen waarden identifisearre yn dizze sletten gearkomste, fariearjend fan 8,5 oant 65,9 kb.
figuer 6. Circos diagram fan sletten genomen fan P.copri en Cibiobacter sp.
Referinsje
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Folsleine, sletten baktearjele genomen fan mikrobiomen mei nanopore-sekwinsje.Natuer biotechnology,38(6), 701-707.
Technyk en hichtepunten stribbet nei it dielen fan de meast resinte súksesfolle tapassing fan ferskate technologyen foar sekwinsjes mei hege trochset yn ferskate ûndersyksarena's, lykas briljante ideeën yn eksperiminteel ûntwerp en data mining.
Post tiid: Jan-07-2022