Full-Length mRNA Sequencing-Nanopore
Service Foardielen
● Low sequence bias
● It iepenbierjen fan cDNA-molekulen mei folsleine lingte
● Minder gegevens nedich om itselde oantal transkripsjes te dekken
● Identifikaasje fan meardere isofoarmen per gen
● Ekspresje kwantifikaasje yn isoform nivo
Service Spesifikaasjes
| Biblioteek | Perron | Oanrikkemandearre gegevensopbringst (Gb) | Kwaliteitsbeweitsing |
| cDNA-PCR(Poly-A ferrike) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/sample (ôfhinklik fan soarte) | Folsleine-lingte ferhâlding＞70% Gemiddelde kwaliteit skoare: Q10
|
Bioinformatika analyzes
●Raw gegevens ferwurking
● Transkripsje identifikaasje
● Alternative splicing
● Ekspresje kwantifikaasje yn gennivo en isofoarmnivo
● Differinsjaal ekspresje analyze
● Funksjeannotaasje en ferriking (DEG's en DET's)
Sample easken en levering
Sample easken:
Nukleotiden:
| Konk.(ng/μl) | Bedrach (μg) | Purity | Yntegriteit |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Beheinde as gjin proteïne- of DNA-fersmoarging werjûn op gel. | Foar planten: RIN≥7.0; Foar bisten: RIN≥7.5; 5.0≥28S/18S≥1.0; beheind of gjin baseline hichte |
Tissue: Gewicht (droech): ≥1 g
* Foar weefsel lytser dan 5 mg, riede wy oan om flash beferzen (yn floeibere stikstof) weefselmonster te stjoeren.
Selophinging: Seltal = 3 × 106- 1×107
* Wy riede oan om beferzen sel lysate te ferstjoeren.Yn gefal dat sel telt lytser as 5 × 105, flash beferzen yn floeibere stikstof wurdt oanrikkemandearre, dat is de foarkar foar mikro-ekstraksje.
Bloedmonsters: Volume≥1 ml
Oanrikkemandearre Sample Delivery
Container: 2 ml centrifuge tube (Tin folie is net oan te rieden)
Sample labeling: Groep + replikearje bgl. A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Ferstjoering: 2、Dry-iis: Samples moatte wurde ferpakt yn sekken en begroeven yn droech-iis.
- RNA-stabiele buizen: RNA-monsters kinne wurde droege yn RNA-stabilisaasjebuis (bygelyks RNAstable®) en ferstjoerd yn keamertemperatuer.
Service Work Flow
Nukleotiden:
Sample levering
Biblioteekbou
Sequencing
Data analyze
Nei-ferkeap tsjinsten
Service Work Flow
Weefsel:
Eksperimint ûntwerp
Sample levering
RNA-ekstraksje
Biblioteekbou
Sequencing
Data analyze
Nei-ferkeap tsjinsten
1.Differinsjaal ekspresje analyze - Volcano plot
Differinsjaal ekspresje-analyze kin wurde ferwurke yn sawol gennivo om differinsjaal útdrukte genen (DEG's) te identifisearjen en yn isofoarmnivo om differinsjaal te identifisearjen
útdrukte transkripsjes (DET's)
2.Hierarchyske klustering heatmap
3.Alternative splicing identifikaasje en klassifikaasje
Fiif soarten alternative splicing-eveneminten kinne wurde foarsizze troch Astalavista.
4.Identifikaasje fan alternative poly-adenylaasje (APA) eveneminten en motyf op 50 bp streamop fan poly-A
BMK gefal
Alternative splitsingsidentifikaasje en kwantifikaasje op isofoarmnivo troch nanopore transkriptoomsekwinsje fan folsleine lingte
Publisearre:Natuerkommunikaasje, 2020
Sequencing strategy:
Groepearring: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E mutaasje);3. Normale B-sellen
Sequencing strategy: MinION 2D biblioteek sequencing, PromethION 1D biblioteek sequencing;koarte-lêzen gegevens út deselde samples
Sequencing platfoarm: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Key resultaten
1.Isoform-nivo Alternative Splicing Identifikaasje
Langlêzen sekwinsjes machtigje identifikaasje fan mutant SF3B1K700E-feroare splice sites op isoform-nivo.35 alternative 3'SS's en 10 alternative 5'SS's waarden fûn te wêzen signifikant differinsjaal sletten tusken SF3B1K700Een SF3B1WT.33 fan de 35 feroarings waarden nij ûntdutsen troch lang-lêzen sekwinsjes.
2.Isoform-nivo Alternative Splicing kwantifikaasje
Ekspresje fan intron retinsje (IR) isofoarmen yn SF3B1K700Een SF3B1WTwaarden kwantifisearre op basis fan nanopore-sekwinsjes, dy't in wrâldwide down-regulaasje fan IR-isoformen yn SF3B1 sjen litteK700E.
Referinsje
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Transkriptkarakterisaasje fan folsleine lingte fan SF3B1-mutaasje yn chronike lymphozytyske leukemy ûntbleatet downregulaasje fan bewarre yntrons [J].Natuerkommunikaasje.
