GÉNOMIQUE HUMAINE
génétique naturelle
Le séquençage à lecture longue identifie les expansions de répétitions de GGC dans NOTCH2NLC associées à une maladie d'inclusion intranucléaire neuronale
Reséquençage ONT |Illumine |Séquençage de l'exome entier |Séquençage ciblé CRISPR-Cas9 ONT |Séquençage d'ARN |Appel de méthylation ONT 5mC
Points forts
1.Par analyse de liaison sur une grande famille NIID, deux régions liées ont été identifiées.
Le séquençage à lecture longue basé sur 2.ONT et le séquençage ONT d'enrichissement médié par Cas-9 ont découvert une cause génétique potentielle des expansions répétées du NIID et du GGC dans 5 'UTR de NOTCH2NLC.Cette étude a rapporté pour la première fois des expansions répétées de gènes spécifiques à l’homme, évoluant par duplication segmentaire.
3.Le séquençage de l'ARN a révélé des transcriptions antisens anormales au début ou à l'intérieur des régions d'expansion de répétition GGC dans NOTCH2NLC.
Arrière-plan
NLa maladie des inclusions intranucléaires euronales (NIID) est une maladie neurodégénérative progressive et mortelle, caractérisée par la présence d'inclusions intranucléaires hyalines éosinophiles dans les systèmes nerveux central et périphérique.Ses manifestations cliniques très variables soulèvent de grandes difficultés de diagnostic jusqu'à l'introduction de la biopsie cutanée.Cependant, les méthodes basées sur l’histopathologie souffrent toujours d’erreurs de diagnostic, ce qui nécessite une compréhension génétique du NIID.
Réalisations
Analyse des liens
SLe séquençage du génome entier (WGS) et le séquençage de l'exome entier (WES) basés sur le séquençage à lecture courte ont été réalisés sur une grande famille NIID (13 membres affectés et 7 membres non affectés).L'analyse de liaison sur les SNP extraits de ces données n'a révélé que deux régions liées : une région de 3,5 Mo à 1p36.31-p36.22 (LOD maximale = 2,32) et une région de 58,1 Mo à 1p22.1-q21.3 (LOD maximale : 4,21). ).Cependant, aucun SNP ou CNV pathogènes n'a été identifié dans ces régions liées.
Extensions répétées de GGC dans NOTCH2NLC
NLe séquençage basé sur l'anopore a été traité sur 13 membres affectés et 4 membres non affectés issus de 8 familles (un autre membre affecté a été séquencé par la plateforme de séquençage à lecture longue Pacbio.).Les données à lecture longue ont révélé des expansions de répétitions GGC associées à la maladie dans la région 5 'UTR de la cartographie du gène NOTCH2NLC dans une région liée de 58, 1 Mo (Figure 1).Ces expansions répétées ont également été identifiées dans les 40 cas sporadiques de NIID testés par RP-PCR.
CLe séquençage cible médié par as-9 sur une plate-forme nanopore a été utilisé pour obtenir une couverture de lecture plus élevée sur la répétition NOTCH2NLC (100 X-1 795 X).Ces séquences consensus concordaient bien avec les découvertes précédentes sur les expansions répétées de GGC.De plus, les répétitions {(GGA)n (GGC)n}n ont été identifiées comme un marqueur génétique potentiel du phénotype à dominante faiblesse (Figure 2).
Figure 1. Expansion répétée associée à la maladie identifiée sur l'exon 1 des isoformes NOTCH2NLC.
Figure 2. Séquences consensus de répétition de NPTCH2NLC chez des patients NIID avec (*) ou sans phénotype de faiblesse dominante
NLes gènes OTCH2NL sont des gènes spécifiques à l’humain, censés jouer un rôle essentiel dans l’évolution du cerveau humain et dans les maladies neurologiques.Cependant, trois gènes liés à NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB et NOTCH2NLC) avec une identité de séquence > 99,1 % n'ont pas été résolus avant le dernier assemblage du génome humain.Le séquençage sans synthèse et à lecture longue sur une plate-forme nanopore a montré des avantages notables dans la résolution de régions de forte similarité et de répétitions (GGC)n riches en GC à 100 %.
Extensions répétées de GGC dans NOTCH2NLC
TLe séquençage du ranscriptome a été traité sur 2 membres affectés et 2 membres non affectés.La profondeur de lecture normalisée a été calculée sur les brins sens et antisens en amont des premiers exons des paralogues NOTCH2NL.Des transcriptions antisens anormales n'ont été trouvées que dans les cas affectés, situés au début ou à l'intérieur de la région d'expansion répétée (pics violets dans F1-14 et F1-16 sur la figure 3).De plus, 54 DEG ont été identifiés et tous ont été enrichis en termes GO et MPO liés aux fonctions neuronales.
Figure 3. Profondeur de lecture normalisée en amont du premier exon de NOTCH2NLC dans les cas non affectés (ci-dessus) et affectés (ci-dessous).
Technologie
Technologie Oxford Nanopore (ONT)
NLe séquençage anopore se distingue des autres plateformes de séquençage en ce sens que les nucléotides sont lus directement sans processus de synthèse d'ADN.Lorsqu'un ADN simple brin traverse un pore protéique de taille nanométrique (nanopore), différents nucléotides génèrent différents courants ioniques, qui peuvent être capturés et transférés dans une séquence de bases.La plate-forme de séquençage ONT elle-même ne montre pas de limite technique apparente sur la durée de lecture de l'ADN.Par conséquent, des lectures ultra-longues (ULR) sont disponibles pour un assemblage du génome de haute qualité.De plus, ces lectures extrêmement longues, suffisamment longues pour traverser des caractéristiques de séquence complexes ou des variations structurelles, aident ici à surmonter les limites du séquençage à lecture courte.
Séquençage des nanopores
Identification des variations de structure (SV)
Sle séquençage sans synthèse a largement préservé les informations de méthylation de l'ADN sur la matrice.Les A, T, C et G méthylés génèrent des courants ioniques distincts de ceux non méthylés, qui peuvent être lus directement par la plateforme.Le séquençage des nanopores permet le profilage du génome entier de 5 mC et 6 mA à une résolution mononucléotidique.
Référence
Jun Sone, et.Al.Le séquençage à lecture longue identifie les expansions de répétitions de GGC dans NOTCH2NLC associées à une maladie d'inclusion intranucléaire neuronale.Génétique naturelle (2019)
Technologie et points forts vise à partager les applications réussies les plus récentes de différentes technologies de séquençage à haut débit dans divers domaines de recherche ainsi que des idées brillantes en matière de conception expérimentale et d'exploration de données.
Heure de publication : 06 janvier 2022