Täyspitkä mRNA-sekvensointi-nanopore
Palvelun edut
● Alhainen sekvenssipoikkeama
● Paljastaa täyspitkiä cDNA-molekyylejä
● Saman transkriptiomäärän kattamiseksi tarvitaan vähemmän tietoja
● Useiden isoformien tunnistaminen geeniä kohti
● Ekspression kvantifiointi isoformitasolla
Palvelun tiedot
| Kirjasto | Alusta | Suositeltu tiedon tuotto (Gb) | Laadunvalvonta |
| cDNA-PCR (poly-A-rikastettu) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/näyte (lajista riippuen) | Täyspituussuhde＞ 70 % Keskimääräinen laatupiste: Q10
|
Bioinformatiikan analyysit
●Raakatietojen käsittely
● Transkription tunnistaminen
● Vaihtoehtoinen jatkos
● Ekspression kvantifiointi geenitasolla ja isoformitasolla
● Differentiaalinen lausekeanalyysi
● Funktiomerkinnät ja rikastus (DEG:t ja DET:t)
Näytevaatimukset ja toimitus
Esimerkkivaatimukset:
Nukleotidit:
| Konsentraatio (ng/μl) | Määrä (μg) | Puhtaus | Rehellisyys |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Geelissä näkyy rajoitettu proteiini- tai DNA-kontaminaatio tai ei ollenkaan. | Kasveille: RIN≥7,0; Eläimet: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; rajallinen tai ei ollenkaan perustason nousua |
Kudos: Paino (kuiva): ≥1 g
*Alle 5 mg:n kudokselle suosittelemme pakastetun (nestemäisessä typessä) kudosnäytteen lähettämistä.
Solususpensio: Solumäärä = 3 x 106- 1×107
* Suosittelemme pakastetun solulysaatin lähettämistä.Jos solujen määrä on pienempi kuin 5 × 105, suositellaan pikajäädytystä nestetypessä, mikä on parempi mikrouuttoon.
Verinäytteet: Tilavuus≥1 ml
Suositeltu näytetoimitus
Säiliö: 2 ml sentrifugiputki (tinafoliota ei suositella)
Näytemerkintä: Ryhmä+kopio esim. A1, A2, A3;B1, B2, B3.....
Toimitus: 2、Kuivajää: Näytteet on pakattava pusseihin ja haudattava kuivajäähän.
- RNA-stabiilit putket: RNA-näytteet voidaan kuivata RNA-stabilointiputkessa (esim. RNAstable®) ja toimittaa huoneenlämmössä.
Palvelun työnkulku
Nukleotidit:
Näytteen toimitus
Kirjaston rakentaminen
Jaksotus
Tietojen analysointi
Myynnin jälkeiset palvelut
Palvelun työnkulku
Kudos:
Kokeilusuunnittelu
Näytteen toimitus
RNA:n uuttaminen
Kirjaston rakentaminen
Jaksotus
Tietojen analysointi
Myynnin jälkeiset palvelut
1.Differentiaalinen ilmentymisanalyysi - Tulivuorikaavio
Differentiaalista ilmentymisanalyysiä voidaan käsitellä sekä geenitasolla differentiaalisesti ekspressoituneiden geenien (DEG:t) tunnistamiseksi että isoformitasolla tunnistaakseen differentiaalisesti
ilmaistut transkriptit (DET)
2.Hierarkkinen klusterointilämpökartta
3. Vaihtoehtoinen liitostunniste ja luokitus
Astalavista voi ennustaa viisi tyyppiä vaihtoehtoista liitostapahtumaa.
4.Vaihtoehtoisten polyadenylaatiotapahtumien (APA) tunnistaminen ja motiivi 50 bp ylävirtaan poly-A:sta
BMK kotelo
Vaihtoehtoinen silmukoinnin tunnistus ja isoformitason kvantifiointi nanohuokosten täyspitkällä transkriptomisekvensoinnilla
Julkaistu:Luontoviestintä, 2020
Sekvensointistrategia:
Ryhmittely: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E-mutaatio);3. Normaalit B-solut
Sekvensointistrategia: MinION 2D -kirjaston sekvensointi, PromethION 1D -kirjaston sekvensointi;lyhyesti luettava data samoista näytteistä
Sekvensointialusta: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Tärkeimmät tulokset
1. Isoform-tason vaihtoehtoinen silmukointitunnistus
Pitkään luetut sekvenssit mahdollistavat mutantin SF3B1:n tunnistamisenK700E-muuttuneet silmukointikohdat isoformitasolla.35 vaihtoehtoisen 3′SS:n ja 10 vaihtoehtoisen 5′SS:n havaittiin olevan merkittävästi erilainen silmukoitu SF3B1:n välilläK700Eja SF3B1WT.33 muutoksesta 35:stä löydettiin hiljattain pitkään luettujen sekvenssien avulla.
2. Isoformitason vaihtoehtoisen silmukoinnin kvantifiointi
Introniretentio(IR)-isoformien ilmentyminen SF3B1:ssäK700Eja SF3B1WTkvantifioitiin nanohuokosekvenssejen perusteella, mikä paljastaa SF3B1:n IR-isoformien maailmanlaajuisen alenemisenK700E.
Viite
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et ai.SF3B1-mutaation täyspitkä transkription karakterisointi kroonisessa lymfosyyttisessä leukemiassa paljastaa säilyneiden intronien alentumisen [J].Luontoviestintä.
