Täyspitkä mRNA-sekvensointi - PacBio
Palvelun edut
● Täyspitkän cDNA-molekyylin suora lukeminen 3'-päästä 5'-päähän
● Iso-form-tason resoluutio sekvenssirakenteessa
● Litteraatit erittäin tarkasti ja eheasti
● Erittäin yhteensopiva vaiours-lajien kanssa
● Suuri sekvensointikapasiteetti neljällä PacBio Sequel II -sekvensointialustalla varustettuna
● Pitkä kokemus yli 700 Pacbio-pohjaisesta RNA-sekvensointiprojektista
● BMKCloud-pohjainen tulostoimitus: Räätälöity tiedonlouhinta saatavilla alustalla.
● Jälkimyyntipalvelut voimassa 3 kuukautta projektin päätyttyä
Palvelun tiedot
Alusta: PacBio Sequel II
Sekvensointikirjasto: Poly-A-rikastettu mRNA-kirjasto
Suositeltu tiedonsiirtokapasiteetti: 20 Gb/näyte (lajista riippuen)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Täyspitkät ei-kimeeriset transkriptit
Bioinformatiikan analyysit
● Raakatietojen käsittely
● Transkription tunnistaminen
● Sekvenssirakenne
● Lausekkeen kvantifiointi
● Toimintomerkintä
Näytevaatimukset ja toimitus
Esimerkkivaatimukset:
Nukleotidit:
| Konsentraatio (ng/μl) | Määrä (μg) | Puhtaus | Rehellisyys |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Geelissä näkyy rajoitettu proteiini- tai DNA-kontaminaatio tai ei ollenkaan. | Kasveille: RIN≥7,5; Eläimet: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; rajallinen tai ei ollenkaan perustason nousua |
Kudos: Paino (kuiva):≥1 g
*Alle 5 mg:n kudokselle suosittelemme pakastetun (nestemäisessä typessä) kudosnäytteen lähettämistä.
Solususpensio:Solumäärä = 3×106- 1×107
* Suosittelemme pakastetun solulysaatin lähettämistä.Jos solujen määrä on pienempi kuin 5 × 105, suositellaan pikajäädytystä nestetypessä, mikä on parempi mikrouuttoon.
Verinäytteitä:Tilavuus ≥ 1 ml
Mikro-organismi:Paino ≥ 1 g
Suositeltu näytetoimitus
Säiliö:
2 ml sentrifugiputki (tinafoliota ei suositella)
Näytemerkintä: Ryhmä+kopio esim. A1, A2, A3;B1, B2, B3.....
Lähetys:
1. Kuivajää: Näytteet on pakattava pusseihin ja haudattava kuivajäähän.
2. RNA-stabiilit putket: RNA-näytteet voidaan kuivata RNA-stabilointiputkessa (esim. RNAstable®) ja toimittaa huoneenlämmössä.
Palvelun työnkulku
Kokeilusuunnittelu
Näytteen toimitus
RNA:n uuttaminen
Kirjaston rakentaminen
Jaksotus
Tietojen analysointi
Myynnin jälkeiset palvelut
1.FLNC-pituusjakauma
Täyspitkän ei-kimeerisen luennon (FLNC) pituus osoittaa cDNA:n pituuden kirjaston rakentamisessa.FLNC-pituusjakauma on keskeinen indikaattori arvioitaessa kirjaston rakentamisen laatua.
FLNC lukupituusjakauma
2. Täydellinen ORF-alueen pituusjakauma
Käytämme TransDecoderia ennustamaan proteiinia koodaavia alueita ja vastaavia aminohapposekvenssejä luodaksemme unigeeniset sarjat, jotka sisältävät täydellisen ei-redundantin transkriptioinformaation kaikissa näytteissä.
Täydellinen ORF-alueen pituusjakauma
3.KEGG-reitin rikastusanalyysi
Differentiaalisesti ekspressoituneet transkriptit (DET:t) voidaan tunnistaa kohdistamalla NGS-pohjaiset RNA-sekvensointitiedot PacBio-sekvensointitiedon tuottamiin täysimittaisiin transkriptiosarjoihin.Näitä DET:itä voidaan jatkokäsitellä erilaisiin toiminnallisiin analyyseihin, esim. KEGG-polun rikastusanalyysiin.
DET KEGG -polun rikastus - Pistekaavio
BMK kotelo
Populus-varren transkriptomin kehitysdynamiikka
Julkaistu: Plant Biotechnology Journal, 2019
Sekvensointistrategia:
Näytekokoelma:varsialueet: Nanlin895:n huippu, ensimmäinen solmuväli (IN1), toinen solmuväli (IN2), kolmas solmuväli (IN3), solmuväli (IN4) ja solmuväli (IN5)
NGS-sekvenssi:15 yksilön RNA yhdistettiin yhdeksi biologiseksi näytteeksi.Jokaisesta pisteestä käsiteltiin kolme biologista kopiota NGS-sekvenssiä varten
TGS-sekvenssi:Varsialueet jaettiin kolmeen alueeseen, eli kärkeen, IN1-IN3 ja IN4-IN5.Jokainen alue käsiteltiin PacBio-sekvensointia varten neljän tyyppisillä kirjastoilla: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb ja 3-10 kb.
Tärkeimmät tulokset
1.Yhteensä tunnistettiin 87150 täyspitkää transkriptiota, joista tunnistettiin 2081 uutta isoformia ja 62058 uutta vaihtoehtoista silmukoitua isoformia.
2,1187 lncRNA- ja 356 fuusiogeeniä tunnistettiin.
3. Primaarisesta kasvusta sekundaarikasvuun tunnistettiin 15 838 erilaisesti ilmentynyttä transkriptia 995 eri tavalla ilmennetystä geenistä.Kaikissa DEG:issä 1216 oli transkriptiotekijöitä, joista suurinta osaa ei ole vielä raportoitu.
4.GO-rikastusanalyysi paljasti solunjakautumisen ja hapetus-pelkistysprosessin merkityksen primaarisessa ja sekundaarisessa kasvussa.
Vaihtoehtoiset silmukointitapahtumat ja erilaiset isomuodot
WGCNA-analyysi transkriptiotekijöistä
Viite
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et ai.Populus-varren transkriptomin kehitysdynamiikka.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi: 10.1111/pbi.12958
