متاژنومیکس
ژنوم های باکتریایی کامل و بسته از میکروبیوم ها با استفاده از توالی یابی نانوحفره
توالی یابی نانوحفره |متاژنومیکس |MAGs |چرخه سازی ژنوم باکتری |میکروبیوت روده
نکات برجسته
1. روش جدیدی برای استخراج قطعات بلند DNA در این مطالعه ارائه شد که به استخراج میکروگرم DNA خالص و HMW مناسب برای تعیین توالی طولانی مدت از 300 میلی گرم مدفوع دست یافت.
2. یک گردش کار مونتاژ، Lathe، در این مطالعه معرفی شد، که در آن MAG ها با خواندن طولانی مونتاژ می شدند و با خواندن کوتاه تصحیح می شدند.
3. تراش با مخلوط ساختگی ارزیابی شد.از هر 12 باکتری، 7 باکتری به صورت موفقیت آمیزی به صورت منفرد و 3 باکتری در چهار یا کمتر جمع شدند.
4. تراش بیشتر بر روی نمونه های مدفوع اعمال شد، که 20 ژنوم دایره ای، از جمله Prevotella copri و Cibiobacter sp را ایجاد کرد.که به غنی بودن از عناصر ژنتیکی متحرک معروف بودند.
دستاورد اصلی
پروتکل استخراج DNA HWM
مطالعات متاژنومی روده مبتنی بر توالی خوانی طولانی مدت طولانی از سختی در استخراج DNA با وزن مولکولی بالا (HMW) از مدفوع رنج می برد.در این مطالعه، یک پروتکل استخراج مبتنی بر آنزیم برای جلوگیری از برش گسترده با ضرب مهره در روش‌های سنتی معرفی شد.همانطور که در شکل زیر نشان داده شده است، ابتدا نمونه ها با ترکیبی از آنزیم ها از جمله لیتیک آنزیم، متا پلی زیم و غیره برای تخریب دیواره های سلولی تیمار شدند.DNA آزاد شده توسط سیستم فنل-کلروفرم استخراج شد و به دنبال آن هضم پروتئیناز K و RNase A، خالص سازی ستونی و انتخاب اندازه SPRI انجام شد.این روش موفق به تولید میکروگرم DNA HMW از 300 متر مدفوع شد که الزامات توالی خوانی طولانی مدت را از نظر کیفیت و کمیت برآورده می کند.
شکل 1. طرح استخراج DNA HWM
جریان طرح تراش
همانطور که در شکل زیر توضیح داده شده است، تراش شامل فرآیند موجود فرآیند فراخوانی پایه خام با استفاده از گوپی است.سپس دو مجموعه طولانی خوانده شده توسط Flye و Canu به طور جداگانه تولید می شود و سپس مونتاژ اشتباه شناسایی و حذف می شود.دو مجموعه فرعی با Quickmerge ادغام شده اند.پس از ادغام، مجموعه های بزرگ در سطح مگاباس برای دایره شدن بررسی می شوند.متعاقباً، تصحیح اجماع در مورد این مجامع با خواندن کوتاه پردازش می شود.ژنوم های باکتریایی مونتاژ شده نهایی برای تشخیص و حذف نادرست مونتاژ نهایی پردازش می شوند.
شکل 2. جریان طرح مجموعه تراش
ارزیابی تراش با مخلوط باکتری های ساختگی
یک مخلوط استاندارد ATCC 12 گونه شامل باکتری های گرم مثبت و گرم منفی برای ارزیابی عملکرد پلت فرم توالی یابی نانوحفره و تراش در مونتاژ MAG استفاده شد.در مجموع 30.3 گیگابایت داده توسط پلتفرم نانوحفره با N50 5.9 کیلوبایت تولید شد.تراش تا حد زیادی مونتاژ N50 را به 1.6 تا 4 برابر در مقایسه با سایر ابزارهای مونتاژ طولانی مدت و 2 تا 9 برابر در مقایسه با ابزارهای مونتاژ هیبریدی ارتقا داد.از 12 ژنوم باکتری، هفت ژنوم به صورت منفرد جمع شدند (شکل 3. سیرک با نقطه سیاه).سه مورد دیگر در چهار یا کمتر ترکیب شدند، که در آنها ناقص ترین مجموعه شامل 83 درصد از ژنوم در یک گروه بود.
شکل 3. مجموعه های ژنومی در یک مخلوط باکتریایی 12 گونه ای تعریف شده
کاربرد تراش در نمونه های مدفوع
این روش بیشتر برای نمونه‌های مدفوع انسان به منظور مقایسه شناسایی ارگانیسم و مجاورت مونتاژ با روش‌های موجود، آنالیز مبتنی بر ابر خواندن و خواندن کوتاه اعمال شد.از سه نمونه درگیر، استخراج جدید مبتنی بر آنزیم حداقل 1 میکروگرم به ازای هر 300 میلی گرم از توده ورودی را به همراه داشت.توالی‌یابی نانوحفره‌های این DNA HMW به ترتیب خوانش‌های طولانی با N50 به ترتیب 4.7 kb، 3.0kb و 3.0kb ایجاد کرد.شایان ذکر است، روش حاضر در مقایسه با روش‌های موجود، پتانسیل بالایی در تشخیص میکروبی نشان می‌دهد.تنوع آلفای سطح گونه نسبتاً بالاتری در اینجا در مقایسه با خواندن کوتاه و ابر خواندن نشان داده شد.علاوه بر این، تمام جنس‌های حاصل از تجزیه و تحلیل کوتاه خواندن، حتی موجودات گرم مثبت معمولاً مقاوم به لیز، با این روش بازیابی شدند.
شکل 4. تنوع آلفا و مولفه های تاکسانومیک تعیین شده با روش نانوپوره، کوتاه خواندن و ابر خواندن
Lathe با وجود ورودی سه تا شش برابری داده های خام کمتر، N50 کل مونتاژ بسیار طولانی تری نسبت به مونتاژ کوتاه خواندن و خواندن ابر داشت.پیش‌نویس ژنوم‌ها توسط Contig Bining تولید می‌شدند، که در آن پیش‌نویس‌ها بر اساس کامل بودن، آلودگی، ژن‌های هسته تک نسخه‌ای و غیره به «کیفیت بالا» یا «جزئی» طبقه‌بندی شدند. به خواندن کوتاه و خواندن ابر.
شکل 5. مجاورت مونتاژ هر ارگانیسم هر روش
علاوه بر این، رویکرد مونتاژ کنونی قادر به تولید ژنوم های بسته و دایره ای است.در نمونه‌های مدفوع، هشت ژنوم با کیفیت بالا و تک شاخه جمع‌آوری شد و پنج مورد از این ژنوم به چرخش دقیق رسیدند.رویکرد مطالعه طولانی همچنین ظرفیت قابل توجهی در حل عناصر تکراری در ژنوم نشان داد.دایره ای شدP. copriژنوم با این رویکرد تولید شد، که مشخص شده است که حاوی درجات بالایی از تکرار توالی است.بهترین ترکیب این ژنوم با خواندن کوتاه و خواندن ابر هرگز از N50 130 کیلوبایت تجاوز نکرد، حتی با عمق پوشش 4800X.این عناصر با تعداد کپی بالا به طور کامل با رویکرد طولانی خواندن حل شدند، که اغلب در نقاط شکست مجموعه های کوتاه خواندن یا خواندن ابر یافت می شوند.ژنوم بسته دیگری در این مطالعه گزارش شد که گمان می‌رود عضوی از اخیراً توصیف شده باشدسیبیوباکترکلادپنج فاژ فرضی در این مجموعه بسته شناسایی شد که از 8.5 تا 65.9 کیلوبایت متغیر است.
شکل 6. نمودار سیرکوس ژنوم بسته P.copri و Cibiobacter sp.
ارجاع
Moss، EL، Maghini، DG، & Bhatt، AS (2020).ژنوم های باکتریایی کامل و بسته از میکروبیوم ها با استفاده از توالی یابی نانوحفره.بیوتکنولوژی طبیعت،38(6)، 701-707.
فناوری و نکات برجسته با هدف به اشتراک گذاری آخرین کاربردهای موفق فناوری های مختلف توالی یابی با توان عملیاتی بالا در عرصه های مختلف تحقیقاتی و همچنین ایده های درخشان در طراحی تجربی و داده کاوی.
زمان ارسال: ژانویه-07-2022