رونوشت
طبیعت
ارتباطات
توصیف رونوشت کامل جهش SF3B1 در لوسمی لنفوسیتی مزمن، کاهش اینترون های باقی مانده را نشان می دهد.
رونوشت های کامل|توالی یابی نانوحفره|تجزیه و تحلیل ایزوفرم جایگزین
زمینه
Sجهش‌های اوماتیک در فاکتور پیرایشی SF3B1 به طور گسترده با سرطان‌های مختلف، از جمله لوسمی لنفوسیتی مزمن (CLL)، ملانوم یووه، سرطان سینه و غیره مرتبط است.با این حال، مطالعات روی این الگوهای پیوند جایگزین مدت‌هاست به دلیل محدودیت رونوشت‌های مونتاژ شده کوتاه‌خوان به سطح رویداد و عدم دانش در سطح ایزوفرم محدود شده است.در اینجا، پلتفرم توالی‌یابی نانوحفره برای تولید رونوشت‌های تمام‌قد معرفی شد که امکان بررسی بر روی ایزوفرم‌های AS را فراهم کرد.
طراحی تجربی
آزمایش
گروه بندی:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(جهش K700E);3. سلول های B طبیعی
استراتژی توالی:توالی یابی کتابخانه MinION 2D، توالی یابی کتابخانه PromethION 1D.داده های کوتاه خوانده شده از نمونه های مشابه
پلت فرم توالی یابی:ONT MinION;ONT PromethION;
تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک
نتایج
آدر مجموع 257 میلیون مطالعه از 6 نمونه CLL و 3 سلول B ایجاد شد.به طور متوسط 30.5 درصد از این خوانده ها به عنوان رونوشت های تمام قد شناسایی شدند.
Fتجزیه و تحلیل ایزوفرم جایگزین تمام طول RNA (FLAIR) برای تولید مجموعه ای از ایزوفرم های با اطمینان بالا توسعه داده شد.FLAIR را می توان به صورت زیر خلاصه کرد:
Nanopore reads alignment: شناسایی ساختار رونوشت کلی بر اساس ژنوم مرجع.
Sتصحیح محل اتصال تکه ها: اشتباهات توالی درست (قرمز) با محل اتصال از هر دو اینترون مشروح، اینترون از داده های کوتاه خوانده شده یا هر دو.
Cفروپاشی: خلاصه ایزوفرم های نماینده بر اساس زنجیره های اتصال اتصال (مجموعه گذر اول).بر اساس تعداد خوانده‌های پشتیبان، isof را با اطمینان بالا انتخاب کنید (آستانه: 3).
شکل 1. تجزیه و تحلیل FLAIR برای شناسایی ایزوفرم های تمام قد مرتبط با جهش SF3B1 در CLL
FLAIR 326699 ایزوفرم متصل شده با اطمینان بالا را شناسایی کرد که 90 درصد آنها ایزوفرم های جدید هستند.بسیاری از این ایزوفرم‌های بدون حاشیه‌نویسی، ترکیب‌های جدیدی از اتصالات اتصال شناخته شده بودند (142971)، در حالی که بقیه ایزوفرم‌های جدید حاوی اینترون (21700) یا اگزون جدید (3594) بودند.
Lتوالی‌های خوانده‌شده، شناسایی مکان‌های پیوند جهش یافته SF3B1-K700E را در سطح ایزوفرم تقویت می‌کنند.35 جایگزین 3'SS و 10 جایگزین 5'SS به طور قابل توجهی بین SF3B1-K700E و SF3B1-WT به هم متصل شدند.33 مورد از 35 تغییر به تازگی توسط توالی های طولانی خوانده شده کشف شده است.در داده‌های Nanopore، توزیع فاصله بین 3'SSهای تغییر یافته با SF3B1-K700E تا پیک‌های مکان‌های متعارف در حدود -20 جفت باز است که به طور قابل‌توجهی با توزیع کنترل متفاوت است، مشابه آنچه در توالی‌های خواندن کوتاه CLL گزارش شده است.ایزوفرم های ژن ERGIC3 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت، جایی که یک ایزوفرم جدید حاوی محل اتصال پروگزیمال در SF3B1-K700E فراوانتر یافت شد.هر دو پروگزیمال و دیستال 3'SS با الگوهای AS متمایز تولید ایزوفرم های متعدد مرتبط بودند.
شکل 2. الگوهای پیوند جایگزین 3' شناسایی شده با داده های توالی یابی نانوحفره
تجزیه و تحلیل استفاده از رویداد IR به دلیل اطمینان در شناسایی و کمی سازی IR برای مدت طولانی در تحلیل مبتنی بر خواندن کوتاه محدود بوده است.بیان ایزوفرم‌های IR در SF3B1-K700E و SF3B1-WT بر اساس توالی‌های نانوحفره اندازه‌گیری شد و کاهش جهانی ایزوفرم‌های IR را در SF3B1-K700E نشان داد.
شکل 4. شدت کشاورزی و اتصال شبکه در سه سیستم کشاورزی (A و B).تجزیه و تحلیل تصادفی جنگل (C) و رابطه بین شدت کشاورزی و استعمار AMF (D)
شکل 3. رویدادهای احتباس اینترون در CLL SF3B1-K700E به شدت کاهش می یابد.
فن آوری
توالی خوانی طولانی نانوحفره
Nتوالی یابی آنوپور یک فناوری توالی یابی سیگنال الکتریکی در زمان واقعی تک مولکولی است.
DDNA یا RNA دو رشته ای به پروتئین نانومتخلخل جاسازی شده در بیوفیلم متصل می شود و تحت هدایت پروتئین حرکتی باز می شود.
Dرشته های NA/RNA تحت تأثیر اختلاف ولتاژ با سرعت معینی از پروتئین کانال نانوحفره عبور می کنند.
Mمولکول ها سیگنال های الکتریکی مختلفی را با توجه به ساختار شیمیایی تولید می کنند.
Rتشخیص بی‌درنگ توالی‌ها با فراخوانی پایه به دست می‌آید.
اجرای توالی رونوشت تمام طول
√ اشباع داده ها
برای رسیدن به اشباع داده های قابل مقایسه، 7 برابر کمتر خوانده می شود.
√ شناسایی ساختار رونوشت
شناسایی انواع مختلف ساختاری با اجماع بازخوانی تمام قد از هر رونوشت
√ تجزیه و تحلیل دیفرانسیل در سطح رونوشت - تغییرات پنهان شده توسط کوتاه خوانده شده را آشکار می کند
ارجاع
Tang AD، Soulette CM، Baren MJV، و همکاران.توصیف رونوشت تمام طول جهش SF3B1 در لوسمی لنفوسیتی مزمن، کاهش اینترون های باقی مانده را نشان می دهد [J].ارتباطات طبیعت
فناوری و نکات برجسته با هدف به اشتراک گذاری آخرین کاربردهای موفق فناوری های مختلف توالی یابی با توان عملیاتی بالا در عرصه های مختلف تحقیقاتی و همچنین ایده های درخشان در طراحی تجربی و داده کاوی.
زمان ارسال: ژانویه-08-2022