TRANSKRIPTOMIKA
natura
KOMUNIKAZIOAK
Leuzemia linfozitiko kronikoko SF3B1 mutazioaren transkripzio osoko karakterizazioak agerian uzten du atxikitako introien beherakada erregulatzea.
Transkripzio luzeak|Nanoporoen sekuentziazioa|Isoformen analisi alternatiboak
Aurrekariak
SSF3B1 splicing faktorearen mutazio omatikoak hainbat minbizirekin erlazionatzen direla zabaldu da, besteak beste, leuzemia linfozitiko kronikoa (CLL), ubeleko melanoma, bularreko minbizia, etab. Gainera, irakurketa laburreko transkriptomiko ikerketek SF3B1 mutazioek eragindako splicing eredu aberranteak agerian utzi dituzte.Hala ere, splicing-eredu alternatibo hauei buruzko azterketak gertaera mailara eta isoforma-mailako ezagutza faltara mugatu dira aspaldiko irakurketa laburreko muntatutako transkripzioen muga dela eta.Hemen, nanoporoen sekuentziazio plataforma sartu zen luzera osoko transkripzioak sortzeko, eta horrek AS isoformen inbertigazioa ahalbidetu zuen.
Diseinu Esperimentala
Esperimentuak
Taldekatzea:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutazioa);3. B-zelula normalak
Sekuentziazio estrategia:MinION 2D liburutegiaren sekuentziazioa, PromethION 1D liburutegiaren sekuentziazioa;lagin bereko datuak laburki irakurri
Sekuentziazio plataforma:ONT Minion;ONT PromethION;
Analisi Bioinformatikoa
Emaitzak
Aguztira 257 milioi irakurketa sortu ziren 6 CLL laginetatik eta 3 B-zeluletatik.Irakurketa horien % 30,5, batez beste, iraupen osoko transkripzio gisa identifikatu ziren.
FRNAren (FLAIR) luzerako isoforma alternatiboen analisia garatu zen konfiantza handiko isoforma multzo bat sortzeko.FLAIR honela laburbil daiteke:
Nanoporek lerrokatzea irakurtzen du: erreferentziako genomaren arabera transkripzio-egitura orokorra identifikatu;
Splice junction-en zuzenketa: zuzen ezazu sekuentzia-erroreak (gorria) splice gunearekin introi komentatuetatik, irakurketa laburreko datuetatik edo bietatik;
Collapse: isoforma adierazgarriak laburbildu juntura-kateetan oinarrituta (lehen pasabide multzoa).Hautatu konfiantza altua irakurketa-kopuruaren arabera (Atalasea: 3).
1. Irudia. FLAIR analisia CLLn SF3B1 mutazioarekin lotutako luzera osoko isoformak identifikatzeko
FLAIR-ek konfiantza handiko 326.699 isoforma identifikatu ditu, eta horietatik % 90 isoforma berriak dira.Adierazi gabeko isoforma horietako gehienak juntura ezagunen konbinazio berriak zirela aurkitu zen (142.971), eta gainerako isoforma berriek introia (21.700) edo exoi berria (3594) zuten.
LIrakurri gabeko sekuentziak SF3B1-K700E mutanteak aldatutako splitze guneak identifikatzea ahalbidetzen ditu isoforma mailan.35 alternatiba 3'SS eta 10 alternatiba 5'SS SF3B1-K700E eta SF3B1-WT-ren artean modu ezberdinean lotzen zirela aurkitu zen.35 alterazioetatik 33 luze irakurritako sekuentzien bidez aurkitu ziren.Nanopore-ren datuetan, SF3B1-K700E-k aldatutako 3'SS-en gune kanonikoen gailurren arteko distantziaren banaketa -20 bp ingurukoa da, hau da, kontrol-banaketa batetik nabarmen ezberdintzen dena, CLL irakurketa laburreko sekuentzian jakinarazi denaren antzera.ERGIC3 genearen isoformak aztertu ziren, non splitze gune proximala duen isoforma berri bat ugariago aurkitu zen SF3B1-K700En.3'SS hurbileko zein distaleko AS eredu bereiztuekin lotuta zeuden isoforma anitz sortzen zituzten.
2. Irudia. Nanoporoen sekuentziazio datuekin identifikatutako 3′ splicing eredu alternatiboak
IR gertaeren erabileraren analisia denbora luzez mugatua izan da irakurketa laburrean oinarritutako analisian, IR identifikazioan eta kuantifikazioan konfiantza duelako.SF3B1-K700E eta SF3B1-WT-en IR isoformen adierazpena nanoporoen sekuentziak oinarri hartuta kuantifikatu ziren, SF3B1-K700En IR isoformen beheranzko erregulazio globala agerian utziz.
4. Irudia. Nekazaritza-intentsitatea eta sare-konektibitatea hiru nekazaritza-sistemetan (A eta B);Ausazko baso-analisia (C) eta nekazaritza intentsitatearen eta AMFren kolonizazioaren arteko erlazioa (D)
3. Irudia. Intronen erretentzio-gertaerak beherago araututa daude CLL SF3B1-K700E-n
Teknologia
Irakurketa luzeko nanoporoen sekuentziazioa
Nanopore sekuentziazioa denbora errealeko seinale elektrikoaren sekuentziazio teknologia molekula bakarrekoa da.
Dkate bikoitzeko DNA edo RNA biofilmean txertatuta dagoen proteina nanoporotsuarekin lotuko da eta proteina motorraren gidaritzapean desegiten da.
DNA/RNA kateek nanoporoen kanaleko proteinatik pasatzen dute abiadura jakin batean tentsio-diferentziaren eraginez.
Molekulak seinale elektriko desberdinak sortzen dituzte egitura kimikoaren arabera.
Rsekuentzien denborazko detekzioa oinarrizko deia eginez lortzen da.
Luzera osoko transkriptomaren sekuentziazioaren errendimendua
√ Datuen saturazioa
7 aldiz irakurketa gutxiago behar dira datu konparagarrien saturazioa lortzeko.
√ Transkripzioaren Egituraren Identifikazioa
Hainbat egitura-aldaera identifikatzea transkripzio bakoitzaren adostasun osoko irakurketarekin
√ Transkripzio-mailako analisi diferentziala -Irakurketa laburretan ezkutatzen diren aldaketak agerian utzi
Erreferentzia
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Leuzemia linfozitiko kronikoko SF3B1 mutazioaren transkripzio osoko karakterizazioak agerian uzten du atxikitako introien beherakada [J].Natura Komunikazioak.
Teknologia eta Nabarmenak Errendimendu handiko sekuentziazio-teknologia desberdinen azken aplikazio arrakastatsuena partekatzea du helburu hainbat ikerketa-esparrutan, baita diseinu esperimentaleko eta datu-meatzaritzako ideia bikainak ere.
Argitalpenaren ordua: 2022-08-08