METAGENOOMIKA
Täielikud suletud bakterigenoomid mikrobioomidest, kasutades nanopooride sekveneerimist
Nanopooride järjestamine |Metagenoomika |MAG-id |Bakterite genoomi tsirkularisatsioon |Soolestiku mikrobiota
Esiletõstmised
1. Selles uuringus esitleti uudset meetodit pikkade DNA fragmentide ekstraheerimiseks, mis võimaldas 300 mg väljaheitest eraldada mikrogrammi puhast HMW DNA-d, mis sobib pika lugemisega sekveneerimiseks.
2. Selles uuringus tutvustati montaaži töövoogu Lathe, kus MAG-id koostati pikkade lugemistega ja korrigeeriti lühikeste lugemistega.
3. Treipinki hinnati segasega.7 bakterit 12-st koondati edukalt üksikuteks kontiigideks ja 3 pandi kokku neljaks või vähemaks kontiigiks.
4. Edasi rakendati väljaheiteproovidele treipingi, mis tekitas 20 tsirkulaarset genoomi, sealhulgas Prevotella copri ja kandidaat Cibiobacter sp., mis olid tuntud oma mobiilsete geneetiliste elementide rikkana.
Peamine saavutus
HWM DNA ekstraheerimisprotokoll
Kaua loetud sekveneerimisel põhinevad soolestiku metagenoomilised uuringud on pikka aega kannatanud kõrge molekulmassiga (HMW) DNA väljaheitest eraldamise kõvaduse tõttu.Selles uuringus võeti kasutusele ensüümipõhine ekstraheerimisprotokoll, et vältida traditsiooniliste meetoditega helmeste peksmise ulatuslikku lõikamist.Nagu on näidatud järgmisel joonisel, töödeldi proove rakuseinte lagundamiseks esmalt ensüümide kokteiliga, sealhulgas lüütilise ensüümi, MetaPolyzyme'iga jne.Vabanenud DNA ekstraheeriti fenool-kloroformi süsteemiga, millele järgnes proteinaas K ja RNaasi A lõhustamine, kolonnipõhine puhastamine ja SPRI suuruse valik.Selle meetodi abil õnnestus saada 300 m väljaheitest mikrogramme HMW DNA-d, mis vastab nii kvaliteedi kui ka kvantiteedi osas pikaajalistele järjestusnõuetele.
Joonis 1. HWM DNA ekstraheerimise skeem
Treipingi skeem
Nagu on kirjeldatud järgmisel joonisel, sisaldab Lathe olemasolevat töötlemata põhikõne protsessi, kasutades Guppyt.Seejärel toodavad Flye ja Canu eraldi kaks pikka aega loetud komplekti, millele järgneb koostevea tuvastamine ja eemaldamine.Kaks alamkoostu liidetakse kiirühendamisega.Ühendamisel kontrollitakse megabaasi tasemel suuri sõlmede tsirkulaarsust.Seejärel töödeldakse nende sõlmede konsensuse täpsustamist lühikeste lugemistega.Lõplikult kokkupandud bakterigenoome töödeldakse lõplikuks valesti koostamise tuvastamiseks ja eemaldamiseks.
Joonis 2. Treipingi koostu skeem
Treipingi hindamine imitatsioonibakterite seguga
Nanopooride sekveneerimisplatvormi ja treipingi jõudluse hindamiseks MAG-i koostamisel kasutati standardset ATCC 12 liigi segu, mis sisaldas nii grampositiivseid kui ka gramnegatiivseid baktereid.Kokku genereeriti nanopooride platvormiga 30, 3 Gb andmeid, mille N50 oli 5, 9 kb.Treipink parandas kooste N50 oluliselt 1,6- kuni 4-kordselt võrreldes teiste pikkade monteerimistööriistadega ja 2-9 korda võrreldes hübriidkoostetööriistadega.12 bakteri genoomist koondati seitse üksikuteks osadeks (joonis 3. Musta punktiga tsirkos).Veel kolm pandi kokku neljaks või vähemaks kontiigiks, milles kõige mittetäielikum koost sisaldas 83% genoomist ühes kontiigis.
Joonis 3. Genoomikomplektid määratletud 12 liiki bakterite segus
Treipingi kasutamine väljaheiteproovides
Seda meetodit rakendati ka inimese väljaheiteproovide puhul, et võrrelda organismi tuvastamist ja koostu külgnevust olemasolevate meetoditega, lugemispilve ja lühilugemispõhise analüüsiga.Kolmest kaasatud proovist andis uus ensüümipõhine ekstraheerimine vähemalt 1 μg 300 mg sisendmassi kohta.Nende HMW DNA nanopooride sekveneerimine tekitas pika lugemise N50-ga vastavalt 4,7 kb, 3,0 kb ja 3,0 kb.Eelkõige näitas käesolev meetod suurt potentsiaali mikroobide tuvastamisel võrreldes olemasolevate meetoditega.Võrreldes lühilugemise ja lugemispilvega näidati siin suhteliselt suuremat liigitasemelist alfa mitmekesisust.Lisaks saadi selle meetodiga kõik lühikese lugemisega analüüside perekonnad, isegi tavaliselt lüüsiresistentsed grampositiivsed organismid.
Joonis 4. Nanopore'i, lühilugemis- ja lugemispilvemeetoditega määratud alfade mitmekesisus ja taksonoomilised komponendid
Treipink andis palju pikema kogukoostu N50 kui lühilugemis- ja lugemispilvekomplekt, vaatamata kolm kuni kuus korda väiksemale algandmete sisendile.Mustandi genoomid valmistati kontig-binnimise teel, mille käigus mustandid klassifitseeriti "kõrgekvaliteedilisteks" või "osalisteks" terviklikkuse, saastumise, ühekoopialiste tuumageenide jms alusel. Pikaajaline kokkupanek näitas palju suuremat külgnevust madalamate kuludega võrreldes. lühilugemiseks ja lugemiseks-pilveks.
Joonis 5. Iga meetodi organismipõhise koostu külgnevus
Lisaks on praegune kokkupanemisviis võimeline andma suletud ringikujulisi genoome.Väljaheiteproovides pandi kokku kaheksa kvaliteetset ühekordset genoomi ja viis neist saavutasid tsirkulaariumi.Kaua loetud lähenemisviis näitas ka muljetavaldavat suutlikkust genoomide korduvate elementide lahendamisel.TsirkulaarneP. copriSelle lähenemisviisiga genereeriti genoom, mis on teadaolevalt sisaldanud suurel määral järjestuse kordusi.Selle genoomi parim kokkupanek lühilugemise ja lugemispilve abil ei ületanud kunagi N50 130 kb, isegi 4800-kordse levisügavusega.Need suure koopiaarvuga elemendid lahendati täielikult pika lugemisega lähenemisviisiga, mida sageli leiti lühilugemis- või lugemispilvekomplektide murdepunktides.Selles uuringus teatati veel ühest suletud genoomist, mis arvati olevat hiljuti kirjeldatud genoomi liigeCibiobakterklaad.Selles suletud komplektis tuvastati viis oletatavat faagi, vahemikus 8, 5 kuni 65, 9 kb.
Joonis 6. Tsirkosdiagramm P.copri ja Cibiobacter sp. suletud genoomidest.
Viide
Moss, EL, Maghini, DG ja Bhatt, AS (2020).Täielikud suletud bakterigenoomid mikrobioomidest, kasutades nanopooride sekveneerimist.Looduse biotehnoloogia,38(6), 701-707.
Tehnika ja esiletõstmised eesmärk on jagada erinevate suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogiate uusimaid edukaid rakendusi erinevatel uurimisareenidel ning geniaalseid ideid eksperimentaalses disainis ja andmekaevandamises.
Postitusaeg: jaanuar 07-2022