INIMGENOOMIKA
loodusgeneetika
Kaualoetud sekveneerimine tuvastab GGC korduvad laienemised NOTCH2NLC-s, mis on seotud neuronaalse tuumasisese inklusioonihaigusega
ONT uuesti järjestamine |Illumina |Terve eksoomi järjestamine |CRISPR-Cas9 ONT suunatud järjestus |RNA-seq |ONT 5mC metüülimine
Esiletõstmised
1. Suure NIID perekonna seoste analüüsiga tuvastati kaks seotud piirkonda.
2.ONT-põhine kaualoetav sekveneerimine ja Cas-9 vahendatud rikastamine ONT sekveneerimine avastas NOTCH2NLC 5′ UTR-is NIID, GGC korduslaiendite potentsiaalse geneetilise põhjuse.See uuring teatas esimest korda korduvatest laienemistest inimspetsiifilistes geenides, mis arenesid segmentaalsete dubleerimise teel.
3. RNA sekveneerimine näitas ebanormaalseid antisenss-transkripte NOTCH2NLC GGC korduse laienemispiirkondade alguses või sees.
Taust
Neuronal intranuclear inclusion disease (NIID) on progresseeruv ja surmaga lõppev neurodegeneratiivne haigus, mida iseloomustab eosinofiilsete hüaliinsete intranukleaarsete inklusioonide esinemine kesk- ja perifeerses närvisüsteemis.Selle väga varieeruvad kliinilised ilmingud tekitavad suuri raskusi diagnoosimisel kuni nahabiopsia kasutuselevõtuni.Kuid histopatoloogial põhinevad meetodid kannatavad endiselt valediagnooside all, mis nõuab NIID-i geneetilist mõistmist.
Saavutused
Seoste analüüs
SHort-read-sekveneerimisel põhinev kogu genoomi järjestamine (WGS) ja kogu eksoomi sekveneerimine (WES) viidi läbi suurel NIID perekonnal (13 mõjutatud ja 7 mõjutamata liiget).Nendest andmetest eraldatud SNP-de sidestusanalüüs näitas ainult kahte seotud piirkonda: 3,5 Mb piirkond 1p36,31-p36,22 (maksimaalne LOD = 2,32) ja 58,1 Mb piirkond 1p22,1-q21,3 (maksimaalne LOD: 4,21) ).Nendes seotud piirkondades ei tuvastatud aga patogeenseid SNP-sid ega CNV-sid.
GGC kordab laiendusi NOTCH2NLC-s
NAnopooripõhist sekveneerimist töödeldi 13 mõjutatud ja 4 mõjutamata liikmel 8 perekonnast (teine mõjutatud liige sekveneeriti Pacbio pika lugemise sekveneerimisplatvormi abil.).Kaua loetud andmed näitasid haigusega seotud GGC korduvaid laienemisi NOTCH2NLC geeni 5' UTR-is, mis kaardistati 58,1 Mb seotud piirkonnaga (joonis 1).Need korduvad laienemised tuvastati ka kõigis 40 sporaadilises NIID juhtumis, mida testiti RP-PCR abil.
CNOTCH2NLC korduse (100 X-1795 X) suurema lugemisulatuse saavutamiseks kasutati as-9 vahendatud sihtjärjestamist nanopooride platvormil.Need konsensusjärjestused nõustusid hästi varasemate leidudega GGC korduslaiendite kohta.Lisaks tuvastati {(GGA) n (GGC) n} n kordused nõrkuse domineeriva fenotüübi potentsiaalse geneetilise markerina (joonis 2).
Joonis 1. NOTCH2NLC isovormide 1. eksonil tuvastatud haigusega seotud korduv ekspansioon.
Joonis 2. NPTCH2NLC kordumise konsensusjärjestused NIID patsientidel, kellel on (*) või ilma nõrkuse domineeriva fenotüübita
NOTCH2NL geenid on inimesele spetsiifilised geenid, mis arvatavasti mängivad olulist rolli inimese aju evolutsioonis ja neuroloogilistes haigustes.Kuid kolm NOTCH2-ga seotud geeni (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB ja NOTCH2NLC), mille järjestuse identsus on> 99, 1%, ei lahendatud enne viimast inimese genoomi kokkupanekut.Sünteesivaba ja kaualoetav sekveneerimine nanopooride platvormil on näidanud märkimisväärseid eeliseid suure sarnasusega piirkondade ja (GGC) n korduste lahendamisel 100% GC-rikkaga.
GGC kordab laiendusi NOTCH2NLC-s
Transcriptoomi sekveneerimist töödeldi kahel mõjutatud ja kahel mõjutamata liikmel.Normaliseeritud lugemissügavus arvutati senss- ja antisenss-ahelate põhjal, mis asuvad NOTCH2NL paraloogide esimestest eksonitest ülesvoolu.Ebanormaalseid antisenss-transkripte leiti ainult mõjutatud juhtudel, mis paiknevad korduva laienemispiirkonna alguses või sees (lilla piigid F1-14 ja F1-16 joonisel 3.).Lisaks tuvastati 54 DEG-d ja kõik olid rikastatud neuronaalsete funktsioonidega seotud GO ja MPO terminitega.
Joonis 3. Normaliseeritud lugemissügavus NOTCH2NLC esimesest eksonist ülesvoolu mõjutamata (ülal) ja mõjutatud (all) juhtudel.
Tehnoloogia
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nanopoorne sekveneerimine erineb teistest sekveneerimisplatvormidest selle poolest, et nukleotiide loetakse otse ilma DNA sünteesi protsessita.Kui üheahelaline DNA läbib nanosuuruses valgupoori (nanopoor), tekitavad erinevad nukleotiidid erinevaid ioonvooge, mida saab kinni püüda ja aluste järjestusse üle kanda.ONT sekveneerimisplatvorm ise ei näita DNA lugemise pikkusele ilmset tehnilist piirangut.Seetõttu on kõrge kvaliteediga genoomi kokkupanekuks saadaval ülipikad lugemised (ULR).Veelgi enam, need äärmiselt pikad lugemised, mis on piisavalt pikad, et ületada keerukaid järjestuse tunnuseid või struktuurseid variatsioone, aitavad siin ületada lühikese lugemise järjestuse piiranguid.
Nanopooride järjestamine
Struktuuri variatsiooni (SV) tuvastamine
Ssünteesivaba sekveneerimine säilitas suures osas DNA metüülimise teabe matriitsil.Metüleeritud A, T, C ja G tekitavad metüleerimata vooludest erinevad ioonvoolud, mida saab platvormilt otse lugeda.Nanopooride sekveneerimine võimaldab ühe nukleotiidi eraldusvõimega nii 5 mC kui ka 6 mA kogu genoomi profileerimist.
Viide
Jun Sone, et.al.Kaualoetud sekveneerimine tuvastab GGC korduste laienemised NOTCH2NLC-s, mis on seotud neuronaalse tuumasisese inklusioonihaigusega.Loodusgeneetika (2019)
Tehnika ja esiletõstmised eesmärk on jagada erinevate suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogiate uusimaid edukaid rakendusi erinevatel uurimisareenidel ning geniaalseid ideid eksperimentaalses disainis ja andmekaevandamises.
Postitusaeg: jaanuar 06-2022