TRANSKRIPTOOMIKA
loodus
SIDE
SF3B1 mutatsiooni täispikk transkriptsiooni iseloomustus kroonilise lümfotsüütilise leukeemia korral näitab säilinud intronite allareguleerimist
Täispikad ärakirjad|Nanopooride järjestamine|Alternatiivse isovormi analüüs
Taust
Son laialdaselt teatatud, et splaissimisfaktori SF3B1 omamaatilised mutatsioonid on seotud erinevate vähkkasvajatega, sealhulgas krooniline lümfotsüütleukeemia (CLL), uveaalmelanoom, rinnavähk jne. Lisaks on lühiloelised transkriptoomilised uuringud näidanud SF3B1 mutatsioonidest põhjustatud hälbivaid splaissimismustreid.Nende alternatiivsete splaissimismustrite uuringud on aga lühiajaliselt kokkupandud ärakirjade piiratuse tõttu pikka aega piirdunud sündmuste tasemega ja isovormi tasemel teadmiste puudumisega.Siin tutvustati täispikkade transkriptide genereerimiseks nanopooride sekveneerimisplatvormi, mis võimaldas AS-i isovormide invertigatsiooni.
Eksperimentaalne disain
Eksperimendid
Rühmitamine:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1 (K700E mutatsioon);3. Normaalsed B-rakud
Järjestusstrateegia:MinION 2D raamatukogu sekveneerimine, PromethION 1D raamatukogu sekveneerimine;samade proovide lühiloetavad andmed
Järjestusplatvorm:ONT MinION;ONT PromethION;
Bioinformaatiline analüüs
Tulemused
A6 CLL proovist ja 3 B-rakust saadi kokku 257 miljonit lugemist.Keskmiselt 30,5% neist lugemistest tuvastati täispikkade ärakirjadena.
FRNA (FLAIR) täispikkuses alternatiivse isovormi analüüs töötati välja suure usaldusväärsusega isovormide komplekti loomiseks.FLAIRi võib kokku võtta järgmiselt:
Nanopore read alignment: tuvastage üldine transkriptsioonistruktuur, mis põhineb võrdlusgenoomil;
Splitsi ristmiku parandus: parandage jada vead (punane) splaissimiskohaga kas annoteeritud intronitest, intronitest lühiloetavatest andmetest või mõlemast;
Collapse: esinduslike isovormide kokkuvõte splaissimisühendusahelate põhjal (esmakäigu komplekt).Valige suure usaldusväärsusega isofrom tugilugemiste arvu põhjal (lävi: 3).
Joonis 1. FLAIR-analüüs SF3B1 mutatsiooniga seotud täispikkuses isovormide tuvastamiseks CLL-is
FLAIR tuvastas 326 699 suure usaldusväärsusega splaissitud isovormi, millest 90% on uued isovormid.Enamik neist märkusteta isovormidest leiti olevat uudsed tuntud splaissimisliidete kombinatsioonid (142 971), samas kui ülejäänud uudsed isovormid sisaldasid kas säilinud introni (21 700) või uudset eksonit (3594).
Lloetavad järjestused võimaldavad identifitseerida mutantse SF3B1-K700E muudetud splaissimiskohti isovormi tasemel.Leiti, et 35 alternatiivset 3'SS-i ja 10 alternatiivset 5'SS-i on SF3B1-K700E ja SF3B1-WT vahel oluliselt erinevalt splaissitud.35 muudatusest 33 avastati äsja kaualoetud järjestuste abil.Nanopore'i andmetes on SF3B1-K700E-ga muudetud 3'SS-ide ja kanooniliste saitide tippude vahelise kauguse jaotus umbes -20 aluspaari, mis erineb oluliselt kontrolljaotusest, sarnaselt CLL-i lühilugemisjärjestustes kirjeldatule.Analüüsiti ERGIC3 geeni isovorme, kus SF3B1-K700E-s leiti uudset proksimaalset splaissimiskohta sisaldavat isovormi.Nii proksimaalne kui ka distaalne 3'SS olid seotud erinevate AS-i mustritega, mis tekitasid mitu isovormi.
Joonis 2. Alternatiivsed 3′ splaissimismustrid, mis on tuvastatud nanopooride sekveneerimise andmetega
IR-sündmuste kasutamise analüüs on lühilugemispõhises analüüsis pikka aega olnud piiratud, kuna usaldatakse IR-i tuvastamist ja kvantifitseerimist.IR-isovormide ekspressioon SF3B1-K700E ja SF3B1-WT-s kvantifitseeriti nanopooride järjestuste põhjal, mis näitas SF3B1-K700E IR-isovormide globaalset allareguleerimist.
Joonis 4. Põllumajanduse intensiivsus ja võrguühendus kolmes põllumajandussüsteemis (A ja B);Juhuslik metsaanalüüs (C) ja seos põllumajanduse intensiivsuse ja AMF-i kolonisatsiooni vahel (D)
Joonis 3. Introni rentimise sündmused on CLL-is SF3B1-K700E tugevamalt alla reguleeritud
Tehnoloogia
Nanopore Kaua loetud järjestus
Nanopoorne sekveneerimine on ühe molekuli reaalajas elektriliste signaalide sekveneerimise tehnoloogia.
DKaheahelaline DNA või RNA seondub biokile sisseehitatud nanopoorse valguga ja kerib lahti motoorse valgu juhtimisel.
DNA/RNA ahelad läbivad pingeerinevuse mõjul teatud kiirusega nanopooride kanali valku.
Molekulid genereerivad erinevaid elektrilisi signaale vastavalt keemilisele struktuurile.
RJadade ea-aja tuvastamine saavutatakse baaskõne abil.
Täispika transkriptsiooni järjestuse sooritamine
√ Andmete küllastus
Võrreldava andmeküllastuse saavutamiseks on vaja 7 korda vähem lugemisi.
√ Transkriptsiooni struktuuri identifitseerimine
Erinevate struktuurivariantide tuvastamine iga ärakirja konsensusliku täispika lugemisega
√ Transkriptsioonitaseme diferentsiaalanalüüs – Lühilugemiste poolt peidetud muudatuste paljastamine
Viide
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV jt.SF3B1 mutatsiooni täispikk transkriptsiooni iseloomustus kroonilise lümfotsütaarse leukeemia korral näitab säilinud intronite [J] allareguleerimist.Looduskommunikatsioonid.
Tehnika ja esiletõstmised eesmärk on jagada erinevate suure läbilaskevõimega sekveneerimistehnoloogiate uusimaid edukaid rakendusi erinevatel uurimisareenidel ning geniaalseid ideid eksperimentaalses disainis ja andmekaevandamises.
Postitusaeg: jaanuar 08-2022