TERVE GENOOMI UURIMINE
SARS-CoV-2 genoomika jälgimine paljastab Nsp1 deletsiooni variandi, mis moduleerib I tüüpi interferooni vastust
Nanopore |Illumina |Terve genoomi resekveneerimine |metagenoomika |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies pakkus selles uuringus tehnilist tuge proovide järjestamisel.
Esiletõstmised
1.SARS-CoV-2 genoomi järjestamine ja fülogeetiline analüüs tuvastavad 35 korduvat mutatsiooni, sealhulgas 31 SNP-d ja 4 indelit.
2. Seos 117 kliinilise fenotüübiga paljastab potentsiaalselt
olulised mutatsioonid.
∆500-532 Nsp1 kodeerivas piirkonnas korreleerub madalama viirusega
3.koormus ja seerumi IFN-β.
4. ∆500-532 mutatsiooniga viirusisolaadid kutsuvad esile madalama IFN-I
vastus nakatunud rakkudes.
Eksperimentaalne disain
Saavutused
1. COVID-19 epidemioloogiline ja genoomne seire
Kliinilisi andmeid koguti Hiinas Sichuani provintsis kogu haiguspuhangu perioodi jooksul 22. jaanuarist 2020 kuni 20. veebruarini 2020. Sichuanis kinnitati qPCR-testidega kokku 538 COVID-19 juhtumit, millest 28,8% olid provintsist pärit. kapitali.Kinnitatud juhtumite arv Sichuanis kasvas plahvatuslikult, saavutades haripunkti 30. jaanuaril.Samuti kinnitasid andmed, et sotsiaalne distantseerumine võib olla võtmetegur viiruse leviku tõkestamisel.
Joonis 1. COVID-19 epidemioloogiline uuring Sichuani provintsis Hiinas
2. SARS-CoV-2 genoomi ehitus ja variantide tuvastamine
Mitmekordse PCR amplifikatsiooniga, millele järgnes nanopooride sekveneerimine, genereeriti 248 patsiendilt kokku 310 peaaegu või osaliselt täielikku genoomi umbes.80% genoomidest on kaetud 10 lugemisega (keskmine sügavus: 0,39 M lugemist proovi kohta).
Joonis 2. Iga variandi esinemissagedus Sichuani kohordis
SARS-CoV-2 genoomidest tuvastati kokku 104 SNP-d ja 18 indelit, milles korduvate geneetiliste variantidena tuvastati 31 SNP-d ja 4 indelit.Võrreldes neid 169 Wuhani prooviga ja 81 391 kõrgekvaliteedilise avaliku genoomi järjestusega GISAIDis, on 35-st leitud variandist 29 teistel mandritel.Nimelt leiti, et neli varianti, sealhulgas ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 ja T13243C, esinesid ainult Sichuanis ja Wuhanis ning puudusid GISAIDi andmetest, mis näitab, et need variandid olid suure tõenäosusega improteeritud Wuhanist, mis vastavad patsientide reisiregistrid.
Evolutsioonianalüüsi maksimaalse tõenäosuse (ML) meetodi ja Bayesi molekulaarse kella lähenemisviisidega töödeldi 88 uue viiruse Sichuanist ja 250 kureeritud genoomiga teistest piirkondadest.Genoomid ∆500-532-ga (deletsioonid Nsp1 kodeerivas piirkonnas) leiti fülogeneetilises puus hõredalt.Nsp1 variantide haplotüübi analüüs tuvastas neist 5 mitmest linnast.Need tulemused näitasid, et ∆500-532 esines mitmes linnas ja seda võidakse Wuhanist mitu korda importida.
Joonis 2. Korduvad geneetilised variandid ja fülogeneetiline analüüs SARS-CoV-2 genoomides
3. Kliiniliste tagajärgedega korduvate geneetiliste variantide seos
117 kliinilist fenotüüpi seostati COVID-19 raskusastmega, kusjuures 19 raskusastmega seotud fenotüüpi liigitati rasketeks ja mitterasketeks tunnusteks.Nende tunnuste ja 35 korduva geneetilise variandi vaheline seos visualiseeriti kahe klastri soojuskaardil.GSEA-sarnane järjestatud rikastamise analüüs näitas, et ∆500-532 on negatiivses korrelatsioonis ESR-i, seerumi IFN-β ja CD3+CD8+ T-rakkude arvuga veres.Veelgi enam, qPCR testid näitasid, et ∆500-532 viirusega nakatunud patsientidel oli kõrgeim Ct väärtus, st madalaim viiruskoormus.
Joonis 3. 35 korduva geneetilise variandi seosed kliiniliste fenotüüpidega
4. Viiruse mutatsiooniga seotud kliiniliste fenotüüpide valideerimine
Et mõista ∆500-532 mõju Nsp1 funktsioonidele, transfekteeriti HEK239T rakud plasmiididega, mis ekspresseerisid täispikka, WT Nsp1 ja deletsioonidega mutantseid vorme.Iga töödeldud HEK239T-raku transkriptoomiprofiile töödeldi PCA analüüsi jaoks, mis näitas, et deletsioonimutandid koondusid suhteliselt lähemale ja erinesid oluliselt WT Nsp1-st.Geenid, mis olid mutantides oluliselt ülesreguleeritud, olid peamiselt rikastatud "peptiidide biosünteesi/metaboolse protsessi", "ribonukleoproteiini kompleksi biogeneesi", "valgu sihtimise membraanile/ER-le" jne osas. Lisaks näitasid kaks deletsiooni WT-st erinevat ekspressioonimustrit.
Joonis 4. WT Nsp1 ja deletsioonidega transfekteeritud HEK239T rakkude transkriptoomianalüüs
Üleekspresseeritud uuringus testiti ka deletsioonide mõju IFN-1 vastusele.Näidati, et kõik testitud deletsioonid vähendavad IFN-1 vastust transfekteeritud HEK239T ja A549 rakkudes nii transkriptoomi kui ka valgu tasemel.Huvitaval kombel rikastati deletsioonides oluliselt allareguleeritud geene "kaitsereaktsiooniga viirusele", "viiruse genoomi replikatsioonile", "RNA polümeraasi II transkriptsiooni reguleerimisele" ja "vastusele I tüüpi interferoonile".
Joonis 5. Interferooni signaaliradade allareguleerimine ∆500-532 mutandis
Selles uuringus kinnitasid nende deletsioonide mõju viirusele veel viirusinfektsiooni uuringud.Teatud mutantidega viirused eraldati kliinilistest proovidest ja nakatati Calu-3 rakkudega.Viirusinfektsiooni uuringu üksikasjalikke tulemusi saab lugeda artiklist.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Viide
Lin J, Tang C, Wei H jt.SARS-CoV-2 genoomne jälgimine paljastab Nsp1 deletsiooni variandi, mis moduleerib I tüüpi interferooni vastust [J].Rakuperemees ja mikroob, 2021.
Uudised ja tipphetked eesmärk on jagada uusimaid edukaid juhtumeid ettevõttega Biomarker Technologies, jäädvustada nii uudseid teadussaavutusi kui ka uuringu käigus kasutatud silmapaistvaid tehnikaid.
Postitusaeg: jaanuar 06-2022