Pikk mittekodeeriv järjestus-Illumina
Teenuse eelised
● Teenuse eelised
● Raku- ja koespetsiifiline
● Konkreetne etapp väljendab ja esitleb dünaamilist väljendusmuutust
● Täpsed aja- ja ruumiväljenduse mustrid
● Ühine analüüs mRNA andmetega.
● BMKCloud-põhine tulemuste edastamine: platvormil on saadaval kohandatud andmekaeve.
● Müügijärgsed teenused kehtivad 3 kuud pärast projekti lõppemist
Näidisnõuded ja kohaletoimetamine
| Raamatukogu | Platvorm | Soovitatavad andmed | Andmete QC |
| rRNA ammendumine | Illumina PE150 | 10 Gb | Q30≥85% |
| Kontsentr. (ng/μl) | Kogus (μg) | Puhtus | Terviklikkus |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Geelil näidatud valgu- või DNA-saaste on piiratud või puudub üldse. | Taimedele: RIN≥6,5; Loomadele: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; algtaseme tõus on piiratud või puudub |
Nukleotiidid:
Kude: kaal (kuiv): ≥1 g
*Kudede puhul, mis on väiksemad kui 5 mg, soovitame saata kiirkülmutatud (vedelas lämmastikus) koeproov.
Rakkude suspensioon: rakkude arv = 3 × 107
*Soovitame tarnida külmutatud rakulüsaati.Kui selle rakkude arv on väiksem kui 5 × 105, on soovitatav kiirkülmutada vedelas lämmastikus.
Vereproovid:
PA×geneBloodRNATube;
6 ml TRIzol ja 2 ml verd (TRIzol: Blood = 3: 1)
Soovitatav näidiste kohaletoimetamine
Mahuti: 2 ml tsentrifuugitoru (tinafoolium pole soovitatav)
Näidismärgistus: rühm+kordus nt A1, A2, A3;B1, B2, B3.....
Saadetis:
1. Kuivjää: proovid tuleb pakkida kottidesse ja matta kuivjäässe.
2. RNA-stabiilsed torud: RNA proove saab kuivatada RNA stabiliseerimiskatsutis (nt RNAstable®) ja tarnida toatemperatuuril.
Teeninduse töövoog
Katsekujundus
Näidiste kohaletoimetamine
RNA ekstraheerimine
Raamatukogu ehitus
Järjestus
Andmete analüüs
Müügijärgsed teenused
Bioinformaatika
1.LncRNA klassifikatsioon
Nelja ülaltoodud tarkvara ennustatud LncRNA liigitati 4 kategooriasse: lincRNA, antisenss-LncRNA, intronic-LncRNA;sense-LncRNA.LncRNA klassifikatsioon on näidatud alloleval histogrammil.
LncRNA klassifikatsioon
2. DE-lncRNA rikastamise analüüsi cis-sihitud geenid
ClusterProfilerit kasutati bioloogiliste protsesside, molekulaarsete funktsioonide ja rakukomponentide osas diferentsiaalselt ekspresseeritud lncRNA (DE-lncRNA) cis-sihitud geenide GO rikastamise analüüsis.GO rikastamise analüüs on protsess DEG-suunatud oluliselt rikastatud GO terminite tuvastamiseks võrreldes kogu genoomiga.Rikastatud terminid esitati histogrammis, mulldiagrammis jne, nagu allpool näidatud.
DE-lncRNA rikastamise analüüsi cis-sihitud geenid - mulldiagramm
3. Võrreldes mRNA ja lncRNA pikkust, eksonite arvu, ORF-i ja ekspressioonikogust, saame aru erinevustest nende struktuuris, järjestuses ja muus osas ning samuti kontrollida, kas meie poolt ennustatud uudne lncRNA vastab üldistele omadustele.
BMK juhtum
Dereguleeritud lncRNA ekspressiooniprofiil hiire kopsu adenokartsinoomides KRAS-G12D mutatsiooni ja P53 väljalangemisega
Avaldatud:Raku- ja molekulaarmeditsiini ajakiri,2019
Järjestusstrateegia
Illumina
Näidiste kogumine
NONMMUT015812-knockdown KP (shRNA-2) rakud ja negatiivse kontrolli (sh-Scr) rakud saadi spetsiifilise viirusnakkuse 6. päeval.
Peamised tulemused
Selles uuringus uuritakse P53 knockouti ja KrasG12D mutatsiooniga hiire kopsu adenokartsinoomi aberrantselt ekspresseeritud lncRNA-sid.
1,6424 lncRNA-d ekspresseeriti erinevalt (≥ 2-kordne muutus, P < 0,05).
2. Kõigist 210 lncRNA-st (FC≥8) reguleeris primaarsetes KP rakkudes 11 lncRNA ekspressiooni P53, 33 lncRNA ekspressiooni KRAS ja 13 lncRNA ekspressiooni hüpoksiaga.
3.NONMMUT015812, mis oli hiire kopsu adenokartsinoomi korral märkimisväärselt ülesreguleeritud ja P53 reekspressiooniga negatiivselt reguleeritud, tuvastati selle rakufunktsiooni analüüsimiseks.
4. NONMMUT015812 hävitamine shRNA-de poolt vähendas KP-rakkude proliferatsiooni ja migratsioonivõimet.NONMMUT015812 oli potentsiaalne onkogeen.
 NONMMUT015812-knockdown KP rakkudes erinevalt ekspresseeritud geenide KEGG raja analüüs |  NONMMUT015812-knockdown KP rakkudes erinevalt ekspresseeritud geenide geeniontoloogia analüüs |
Viide
Dereguleeritud lncRNA ekspressiooniprofiil hiire kopsu adenokartsinoomides, millel on KRAS-G12D mutatsioon ja P53 knockout [J].Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
