Täispikk mRNA sekveneerimine - nanopoor
Teenuse eelised
● Madal järjestuse kallutatus
● Täispikkade cDNA molekulide paljastamine
● Sama arvu ärakirjade katmiseks on vaja vähem andmeid
● Mitme isovormi identifitseerimine geeni kohta
● Ekspressiooni kvantifitseerimine isovormi tasemel
Teenuse spetsifikatsioonid
| Raamatukogu | Platvorm | Soovitatav andmemaht (Gb) | Kvaliteedi kontroll |
| cDNA-PCR (polü-A-ga rikastatud) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb proovi kohta (olenevalt liigist) | Täispikkusesuhe＞70% Keskmine kvaliteediskoor: Q10
|
Bioinformaatika analüüsid
●Toorandmete töötlemine
● Ärakirja tuvastamine
● Alternatiivne splaissimine
● Ekspressiooni kvantifitseerimine geenitasemel ja isovormi tasemel
● Diferentsiaalväljenduse analüüs
● Funktsiooni annotatsioon ja rikastamine (DEG-id ja DET-id)
Näidisnõuded ja kohaletoimetamine
Näidisnõuded:
Nukleotiidid:
| Kontsentr. (ng/μl) | Kogus (μg) | Puhtus | Terviklikkus |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230 = 0,5-2,5 Geelil näidatud valgu- või DNA-saaste on piiratud või puudub üldse. | Taimedele: RIN≥7,0; Loomadele: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; algtaseme tõus on piiratud või puudub |
Kude: kaal (kuiv): ≥1 g
*Kudede puhul, mis on väiksemad kui 5 mg, soovitame saata kiirkülmutatud (vedelas lämmastikus) koeproov.
Rakkude suspensioon: rakkude arv = 3 × 106- 1 × 107
*Soovitame tarnida külmutatud rakulüsaati.Kui selle rakkude arv on väiksem kui 5 × 105Soovitatav on kiirkülmutamine vedelas lämmastikus, mis on eelistatav mikroekstraktsiooni jaoks.
Vereproovid: maht≥1 ml
Soovitatav näidiste kohaletoimetamine
Mahuti: 2 ml tsentrifuugitoru (tinafoolium pole soovitatav)
Näidismärgistus: rühm+kordus nt A1, A2, A3;B1, B2, B3.....
Saadetis: 2, kuivjää: proovid tuleb pakkida kottidesse ja matta jäässe.
- RNA-stabiilsed torud: RNA proove saab kuivatada RNA stabiliseerimiskatsutis (nt RNAstable®) ja tarnida toatemperatuuril.
Teeninduse töövoog
Nukleotiidid:
Näidiste kohaletoimetamine
Raamatukogu ehitus
Järjestus
Andmete analüüs
Müügijärgsed teenused
Teeninduse töövoog
Pabertaskurätik:
Katsekujundus
Näidiste kohaletoimetamine
RNA ekstraheerimine
Raamatukogu ehitus
Järjestus
Andmete analüüs
Müügijärgsed teenused
1.Diferentsiaalekspressiooni analüüs - Vulkaani graafik
Diferentsiaalse ekspressiooni analüüsi saab töödelda nii geenitasemel, et tuvastada erinevalt ekspresseeritud geene (DEG) kui ka isovormi tasemel, et tuvastada diferentsiaalselt
väljendatud ärakirjad (DET)
2.Hierarhiline klastrite soojuskaart
3. Alternatiivse splaissimise identifitseerimine ja klassifikatsioon
Astalavista suudab ennustada viit tüüpi alternatiivseid splaissimise sündmusi.
4.Alternatiivse polüadenüülimise (APA) sündmuste identifitseerimine ja motiiv 50 aluspaari kaugusel polü-A-st ülesvoolu
BMK juhtum
Alternatiivne splaissimise tuvastamine ja isovormi tasemel kvantifitseerimine nanopooride täispika transkriptoomi sekveneerimise abil
Avaldatud:Looduskommunikatsioonid, 2020
Järjestusstrateegia:
Rühmitamine: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (K700E mutatsioon);3. Normaalsed B-rakud
Sekveneerimisstrateegia: MinION 2D raamatukogu sekveneerimine, PromethION 1D raamatukogu sekveneerimine;samade proovide lühiloetavad andmed
Järjestusplatvorm: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Peamised tulemused
1. Isovormi tasemel alternatiivne splaissimise identifitseerimine
Pikalt loetud järjestused võimaldavad mutandi SF3B1 tuvastadaK700E- muudetud splaissimiskohad isovormi tasemel.Leiti, et 35 alternatiivset 3′SS-i ja 10 alternatiivset 5′SS-d on SF3B1 vahel oluliselt erinevalt splaissitudK700Eja SF3B1WT.35 muudatusest 33 avastati äsja kaualoetud järjestuste abil.
2. Isovormi tasemel alternatiivse splaissimise kvantifitseerimine
Introni retentsiooni (IR) isovormide ekspressioon SF3B1-sK700Eja SF3B1WTkvantifitseeriti nanopooride järjestuste põhjal, mis näitas SF3B1 IR-isovormide globaalset allareguleerimistK700E.
Viide
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV jt.SF3B1 mutatsiooni täispikk transkriptsiooni iseloomustus kroonilise lümfotsütaarse leukeemia korral näitab säilinud intronite [J] allareguleerimist.Looduskommunikatsioonid.
