Tooted

Täispikk mRNA sekveneerimine - PacBio

De novotäispikk transkriptoomide järjestamine, tuntud ka kuiDe novoIso-Seq kasutab PacBio sekvenseri eeliseid lugemispikkuses, mis võimaldab järjestada täispikka cDNA molekule ilma pausideta.See väldib täielikult transkriptsiooni koostamise etappides tekkivaid vigu ja loob unigeensed komplektid isovormi tasemel eraldusvõimega.Need unigeensed komplektid pakuvad transkriptoomi tasemel võimsat geneetilist teavet "võrdlusgenoomina".Lisaks annab see teenus kombineerituna järgmise põlvkonna järjestusandmetega isovormi tasemel ekspressiooni täpseks kvantifitseerimiseks.

Platvorm: PacBio Sequel II

Raamatukogu: SMRT kellade raamatukogu

Võta meiega ühendust

Teenuse üksikasjad

Demo tulemused

Juhtumiuuring

Teenuse eelised

● Täispika cDNA molekuli otselugemine 3'-otsast 5'-otsani

● Iso-vormi taseme eraldusvõime järjestuse struktuuris

● Suure täpsuse ja terviklikkuse transkriptsioonid

● Väga ühilduv vaioursi liikidega

● Suur sekveneerimisvõimsus koos 4 varustatud PacBio Sequel II sekveneerimisplatvormiga

● Suure kogemusega rohkem kui 700 Pacbio-põhise RNA sekveneerimisprojektiga

● BMKCloud-põhine tulemuste edastamine: platvormil on saadaval kohandatud andmekaeve.

● Müügijärgsed teenused kehtivad 3 kuud pärast projekti lõppemist

Teenuse spetsifikatsioonid

Platvorm: PacBio Sequel II

Järjestusraamatukogu: polü-A-ga rikastatud mRNA raamatukogu

Soovitatav andmemaht: 20 Gb/proov (olenevalt liigist)

FLNC（%）： ≥75%

*FLNC: täispikad mittekimäärsed transkriptid

Bioinformaatika analüüsid

● Toorandmete töötlemine

● Ärakirja tuvastamine

● Jada struktuur

● Avaldise kvantifitseerimine

● Funktsiooni annotatsioon

Näidisnõuded ja kohaletoimetamine

Näidisnõuded:

Nukleotiidid:

Kontsentr. (ng/μl)

Kogus (μg)

Puhtus

Terviklikkus

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280 = 1,7-2,5

OD260/230 = 0,5-2,5

Geelil näidatud valgu- või DNA-saaste on piiratud või puudub üldse.

Taimedele: RIN≥7,5;

Loomadele: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

algtaseme tõus on piiratud või puudub

Kude: kaal (kuiv):≥1 g
*Kudede puhul, mis on väiksemad kui 5 mg, soovitame saata kiirkülmutatud (vedelas lämmastikus) koeproov.

Rakkude suspensioon:Rakkude arv = 3 × 10⁶- 1 × 10⁷
*Soovitame tarnida külmutatud rakulüsaati.Kui selle rakkude arv on väiksem kui 5 × 10⁵Soovitatav on kiirkülmutamine vedelas lämmastikus, mis on eelistatav mikroekstraktsiooni jaoks.

Vereproovid:Maht ≥1 ml

Mikroorganism:Mass ≥ 1 g

Soovitatav näidiste kohaletoimetamine

Konteiner:
2 ml tsentrifuugitoru (tinafoolium ei ole soovitatav)
Näidismärgistus: rühm+kordus nt A1, A2, A3;B1, B2, B3.....

Saadetis:

1. Kuivjää: proovid tuleb pakkida kottidesse ja matta kuivjäässe.
2. RNA-stabiilsed katseklaasid: RNA proove saab kuivatada RNA stabiliseerimiskatsutis (nt RNAstable®) ja tarnida toatemperatuuril.

Teeninduse töövoog

Katsekujundus

Näidiste kohaletoimetamine

RNA ekstraheerimine

Raamatukogu ehitus

Järjestus

Andmete analüüs

Müügijärgsed teenused

Eelmine: Eukarüootne mRNA sekveneerimine-Illumina

Järgmine: Täispikk mRNA sekveneerimine - nanopoor

1.FLNC pikkusjaotus

Täispika mittekimäärse lugemise (FLNC) pikkus näitab cDNA pikkust raamatukogu ehitamisel.FLNC pikkusjaotus on raamatukogu ehituse kvaliteedi hindamisel ülioluline näitaja.

mRNA-FLNC-lugemispikkus-jaotus

FLNC lugemise pikkuse jaotus

2. Täielik ORF-i piirkonna pikkusjaotus

Kasutame TransDecoderit, et ennustada valke kodeerivaid piirkondi ja vastavaid aminohappejärjestusi, et genereerida unigeenseid komplekte, mis sisaldavad kõigis proovides täielikku mitteliigset transkriptsiooniteavet.

mRNA-Täielik-ORF-pikkus-jaotus

Täielik ORF-i piirkonna pikkuse jaotus

3.KEGG raja rikastamise analüüs

Erinevalt ekspresseeritud transkripte (DET-e) saab tuvastada, joondades NGS-põhise RNA sekveneerimisandmed täispikkade transkriptsioonikomplektidega, mis on genereeritud PacBio sekveneerimisandmetega.Neid DET-sid saab edasi töödelda mitmesuguste funktsionaalsete analüüside jaoks, nt KEGG raja rikastamise analüüsiks.

mRNA-DEG-KEGG-raja rikastamine

DET KEGG raja rikastamine - Punktgraafik

BMK juhtum

Populuse tüve transkriptoomi arengudünaamika

Avaldatud: Taimede biotehnoloogia ajakiri, 2019

Järjestusstrateegia:
Näidiskogu:tüvepiirkonnad: tipp, esimene sõlmedevaheline (IN1), teine sõlmedevahe (IN2), kolmas sõlmedevahe (IN3), sõlmedevaheline (IN4) ja internode (IN5) Nanlin895-st
NGS-järjestus:15 isendi RNA ühendati üheks bioloogiliseks prooviks.NGS-järjestuse jaoks töödeldi iga punkti kolme bioloogilist kordust
TGS-järjestus:Tüvepiirkonnad jagati kolmeks piirkonnaks ehk tipuks, IN1-IN3 ja IN4-IN5.Iga piirkonda töödeldi PacBio sekveneerimiseks nelja tüüpi raamatukogudega: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb ja 3-10 kb.

Peamised tulemused

1. Kokku tuvastati 87150 täispikka transkripti, milles tuvastati 2081 uudset isovormi ja 62058 uudset alternatiivset splaissitud isovormi.
Tuvastati 2,1187 lncRNA ja 356 sulandgeeni.
3. Primaarsest kasvust sekundaarse kasvuni tuvastati 15838 erinevalt ekspresseeritud transkripti 995 erinevalt ekspresseeritud geenist.Kõigis DEG-des olid 1216 transkriptsioonifaktorit, millest enamikku pole veel teatatud.
4.GO rikastamise analüüs näitas rakkude jagunemise ja oksüdatsiooni-redutseerimise protsessi tähtsust primaarses ja sekundaarses kasvus.