METAGENOMICA
Genomas bacterianos completos y cerrados de microbiomas mediante secuenciación de nanoporos
Secuenciación de nanoporos |Metagenómica |MAG |Circularización del genoma bacteriano |microbiota intestinal
Reflejos
1. En este estudio se presentó un método novedoso para extraer fragmentos largos de ADN, que logró la extracción de microgramos de ADN HMW puro adecuado para secuenciación de lectura larga a partir de 300 mg de heces.
2. En este estudio se introdujo un flujo de trabajo de ensamblaje, Lathe, donde los MAG se ensamblaron mediante lecturas largas y se corrigieron mediante lecturas cortas.
3.El torno se evaluó mediante una mezcla simulada.7 de 12 bacterias se ensamblaron con éxito en contigs individuales y 3 se ensamblaron en cuatro o menos contigs.
4. Se aplicó además torno a muestras de heces, lo que generó 20 genomas circularizados, incluidos Prevotella copri y el candidato Cibiobacter sp., que eran conocidos por ser ricos en elementos genéticos móviles.
Logro principal
Protocolo de extracción de ADN HWM.
Los estudios metagenómicos intestinales basados en secuenciación de lectura larga se han visto afectados durante mucho tiempo por la dificultad para extraer ADN de alto peso molecular (HMW) de las heces.En este estudio, se introdujo un protocolo de extracción basado en enzimas para evitar un corte extenso mediante batido de perlas en los métodos tradicionales.Como se muestra en la siguiente figura, las muestras se trataron primero con un cóctel de enzimas, incluida la enzima lítica, MetaPolyzyme, etc., para degradar las paredes celulares.El ADN liberado se extrajo mediante un sistema de fenol-cloroformo, seguido de digestión con proteinasa K y ARNasa A, purificación basada en columnas y selección de tamaño SPRI.Este método logró producir microgramos de ADN HMW a partir de 300 m de heces, lo que cumple con los requisitos de secuenciación de lectura larga en términos de calidad y cantidad.
Figura 1. Esquema de extracción de ADN de HWM
Esquema de flujo de torno
Como se describe en la siguiente figura, Lathe contiene un proceso existente de proceso de llamada base sin procesar utilizando Guppy.Luego, Flye y Canu producen dos ensamblajes de lectura larga por separado, seguidos de la detección y eliminación de errores de ensamblaje.Los dos subconjuntos se fusionan con combinación rápida.Al fusionarse, se verifica la circularización de grandes ensamblajes a nivel de megabase.Posteriormente se procesa el afinamiento del consenso sobre estas asambleas con lecturas breves.Los genomas bacterianos ensamblados finales se procesan para la detección y eliminación final de errores de ensamblaje.
Figura 2. Flujo esquemático del montaje del torno.
Evaluación de Torno con mezcla de bacterias simuladas.
Se empleó una mezcla estándar ATCC de 12 especies que comprende bacterias Gram positivas y Gram negativas para evaluar el rendimiento de la plataforma de secuenciación de nanoporos y el torno en el ensamblaje MAG.Se generó un total de 30,3 Gb de datos mediante una plataforma de nanoporos con N50 de 5,9 kb.El torno mejoró en gran medida el ensamblaje N50 de 1,6 a 4 veces en comparación con otras herramientas de ensamblaje de lectura larga y de 2 a 9 veces en comparación con las herramientas de ensamblaje híbridas.De 12 genomas bacterianos, siete se ensamblaron en contigs individuales (Figura 3. Circos con punto negro).Tres más se ensamblaron en cuatro o menos contigs, en los que el ensamblaje más incompleto contenía el 83% del genoma en un solo contig.
Figura 3. Ensamblajes de genomas en una mezcla bacteriana definida de 12 especies
Aplicación de Torno en muestras de heces.
Este método se aplicó además a muestras de heces humanas para comparar la identificación del organismo y la contigüidad del ensamblaje con los métodos existentes, análisis basados en lectura en la nube y lectura corta.De las tres muestras involucradas, la nueva extracción basada en enzimas arrojó al menos 1 μg por 300 mg de masa de entrada.La secuenciación de nanoporos de este ADN de HMW generó lecturas largas con N50 de 4,7 kb, 3,0 kb y 3,0 kb respectivamente.En particular, el método actual mostró un gran potencial en la detección microbiana en comparación con los métodos existentes.Aquí se mostró una diversidad alfa a nivel de especie relativamente mayor en comparación con la lectura corta y la lectura en la nube.Además, mediante este método se recuperaron todos los géneros del análisis de lectura corta, incluso los organismos Gram positivos típicamente resistentes a la lisis.
Figura 4. Diversidad alfa y componentes taxanómicos determinados por los métodos Nanopore, lectura corta y lectura en la nube
El torno produjo un ensamblaje completo N50 mucho más largo que el ensamblaje de lectura corta y de lectura en la nube, a pesar de una entrada de datos sin procesar de tres a seis veces menor.Los borradores de genomas se produjeron mediante agrupación contig, en la que los borradores se clasificaron en “alta calidad” o “parciales” según su integridad, contaminación, genes centrales de copia única, etc. El ensamblaje de lectura larga mostró una contigüidad mucho mayor a un costo menor en comparación a lectura corta y lectura en la nube.
Figura 5. Contigüidad del ensamblaje por organismo de cada método
Además, el actual enfoque de ensamblaje es capaz de producir genomas circulares cerrados.En las muestras de heces, se ensamblaron ocho genomas de un solo contig de alta calidad y cinco de ellos lograron una circularización precisa.El enfoque de lectura larga también demostró una capacidad impresionante para resolver elementos repetitivos en los genomas.circularizadoP. copriEl genoma fue generado mediante este enfoque, que se sabe que contiene un alto grado de repetición de secuencia.El mejor ensamblaje de este genoma mediante lectura corta y lectura en la nube nunca superó el N50 de 130 kb, incluso con una profundidad de cobertura de 4800X.Estos elementos con un alto número de copias se resolvieron por completo mediante un enfoque de lectura larga, que a menudo se encontraba en los puntos de ruptura de los ensamblajes de lectura corta o de lectura en la nube.En este estudio se informó de otro genoma cerrado, que se creía que era miembro de un genoma recientemente descrito.cibiobacteriaclado.Se identificaron cinco supuestos fagos en este conjunto cerrado, con tamaños de 8,5 a 65,9 kb.
Figura 6. Diagrama circos de genomas cerrados de P.copri y Cibiobacter sp.
Referencia
Moss, EL, Maghini, DG y Bhatt, AS (2020).Genomas bacterianos completos y cerrados de microbiomas mediante secuenciación de nanoporos.Biotecnología de la naturaleza,38(6), 701-707.
Tecnología y aspectos destacados tiene como objetivo compartir las aplicaciones exitosas más recientes de diferentes tecnologías de secuenciación de alto rendimiento en diversos campos de investigación, así como ideas brillantes en diseño experimental y minería de datos.
Hora de publicación: 07-ene-2022