GENÓMICA HUMANA
genética de la naturaleza
La secuenciación de lectura larga identifica expansiones de repetición de GGC en NOTCH2NLC asociadas con la enfermedad de inclusión intranuclear neuronal
Resecuenciación ONT |iluminar |Secuenciación completa del exoma |Secuenciación dirigida CRISPR-Cas9 ONT |Sec. de ARN |Llamada de metilación ONT 5mC
Reflejos
1.Mediante el análisis de vinculación en una gran familia NIID, se identificaron dos regiones vinculadas.
2.La secuenciación de lectura larga basada en ONT y la secuenciación de ONT de enriquecimiento mediada por Cas-9 descubrieron una posible causa genética de NIID, expansiones repetidas de GGC en 5 ′ UTR de NOTCH2NLC.Este estudio informó por primera vez expansiones repetidas en genes específicos de humanos que evolucionaron a través de duplicaciones segmentarias.
3. La secuenciación de ARN reveló transcripciones antisentido anormales al principio o dentro de las regiones de expansión repetida de GGC en NOTCH2NLC.
Fondo
NLa enfermedad de inclusión intranuclear euronal (NIID) es una enfermedad neurodegenerativa progresiva y mortal, que se caracteriza por la presencia de inclusiones intranucleares hialinas eosinófilas en los sistemas nerviosos central y periférico.Sus manifestaciones clínicas muy variables plantean grandes dificultades en el diagnóstico hasta la introducción de la biopsia de piel.Sin embargo, los métodos basados en histopatología todavía sufren de diagnósticos erróneos, lo que exige una comprensión genética de la NIID.
Logros
Análisis de vínculos
SLa secuenciación del genoma completo (WGS) y la secuenciación del exoma completo (WES) basadas en secuenciación de lectura corta se realizaron en una gran familia NIID (13 miembros afectados y 7 no afectados).El análisis de vinculación de los SNP extraídos de estos datos reveló solo dos regiones vinculadas: una región de 3,5 Mb en 1p36.31-p36.22 (LOD máximo = 2,32) y una región de 58,1 Mb en 1p22.1-q21.3 (LOD máximo: 4,21 ).Sin embargo, no se identificaron SNP o CNV patógenos en estas regiones vinculadas.
GGC repite expansiones en NOTCH2NLC
NLa secuenciación basada en anopore se procesó en 13 miembros afectados y 4 no afectados de 8 familias (otro miembro afectado fue secuenciado mediante la plataforma de secuenciación de lectura larga Pacbio).Los datos de lectura larga revelaron expansiones de repeticiones de GGC asociadas a la enfermedad en la UTR 5' del mapeo del gen NOTCH2NLC en la región vinculada de 58,1 Mb (Figura 1).Estas expansiones repetidas también se identificaron en los 40 casos esporádicos de NIID analizados por RP-PCR.
CSe empleó la secuenciación objetivo mediada por as-9 en una plataforma de nanoporos para lograr una mayor cobertura de lectura en la repetición NOTCH2NLC (100 X-1795 X).Estas secuencias de consenso coincidieron bien con hallazgos anteriores sobre expansiones repetidas de GGC.Además, se identificaron repeticiones {(GGA)n (GGC)n}n como un marcador genético potencial para el fenotipo de debilidad dominante (Figura 2).
Figura 1. Expansión repetida asociada a la enfermedad identificada en el exón 1 de las isoformas NOTCH2NLC.
Figura 2. Secuencias de consenso de repetición de NPTCH2NLC en pacientes NIID con (*) o sin fenotipo de debilidad dominante
NLos genes OTCH2NL son genes humanos específicos y se cree que desempeñan un papel vital en la evolución del cerebro humano y las enfermedades neurológicas.Sin embargo, tres genes relacionados con NOTCH2 (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB y NOTCH2NLC) con >99,1% de identidad de secuencia no se resolvieron hasta el último ensamblaje del genoma humano.La secuenciación sin síntesis y de lectura larga en una plataforma de nanoporos ha mostrado ventajas notables en la resolución de regiones de alta similitud y repeticiones (GGC)n con 100 % de GC.
GGC repite expansiones en NOTCH2NLC
TLa secuenciación del ranscriptoma se procesó en 2 miembros afectados y 2 miembros no afectados.La profundidad de lectura normalizada se calculó en cadenas sentido y antisentido aguas arriba de los primeros exones de los parálogos de NOTCH2NL.Se encontraron transcripciones antisentido anormales solo en los casos afectados, que se encuentran al principio o dentro de la región de expansión repetida (picos morados en F1-14 y F1-16 en la Figura 3).Además, se identificaron 54 DEG y todos se enriquecieron en términos GO y MPO relacionados con funciones neuronales.
Figura 3. Profundidad de lectura normalizada aguas arriba del primer exón de NOTCH2NLC en casos no afectados (arriba) y afectados (abajo).
Tecnología
Tecnologías de nanoporos de Oxford (ONT)
NLa secuenciación de anopore se distingue de otras plataformas de secuenciación en que los nucleótidos se leen directamente sin un proceso de síntesis de ADN.A medida que una sola cadena de ADN pasa a través de un poro de proteína de tamaño nanométrico (nanoporo), diferentes nucleótidos generan diferentes corrientes iónicas, que pueden capturarse y transferirse a una secuencia de bases.La plataforma de secuenciación ONT en sí no muestra un límite técnico aparente en la duración de la lectura del ADN.Por lo tanto, se encuentran disponibles lecturas ultralargas (ULR) para el ensamblaje del genoma de alta calidad.Además, estas lecturas extremadamente largas, que son lo suficientemente largas como para cruzar características de secuencia complejas o variaciones estructurales, ayudan a superar las limitaciones de la secuenciación de lectura corta aquí.
Secuenciación de nanoporos
Identificación de variación de estructura (SV)
SLa secuenciación sin síntesis conservó en gran medida la información de metilación del ADN en la plantilla.Las A, T, C y G metiladas generan corrientes iónicas distintas de las no metiladas, que pueden ser leídas directamente por la plataforma.La secuenciación de nanoporos permite la elaboración de perfiles de todo el genoma de 5 mC y 6 mA con una resolución de un solo nucleótido.
Referencia
Jun Sone, et.Alabama.La secuenciación de lectura larga identifica expansiones de repeticiones de GGC en NOTCH2NLC asociadas con la enfermedad de inclusión intranuclear neuronal.Genética de la naturaleza (2019)
Tecnología y aspectos destacados tiene como objetivo compartir las aplicaciones exitosas más recientes de diferentes tecnologías de secuenciación de alto rendimiento en diversos campos de investigación, así como ideas brillantes en diseño experimental y minería de datos.
Hora de publicación: 06-ene-2022