Plenlonga mRNA-sekvencado -PacBio
Servaj Avantaĝoj
● Rekta legado de plenlonga cDNA-molekulo de 3'-fino ĝis 5'-fino
● Izo-forma nivela rezolucio en sinsekva strukturo
● Transskribaĵoj kun alta precizeco kaj integreco
● Tre kongrua kun diversaj specioj
● Granda sinsekva kapablo kun 4 PacBio Sequel II-sekvencaj platformoj ekipitaj
● Tre sperta kun pli ol 700 Pacbio-bazitaj RNA-sekvencaj projektoj
● BMKCloud-bazita rezulto livero: Personigita datuma-minado havebla sur platformo.
● Post-vendaj servoj validaj dum 3 monatoj post la finiĝo de la projekto
Specifoj de Servo
Platformo: PacBio Sequel II
Sekvenca biblioteko: Poly A-riĉigita mRNA-biblioteko
Rekomendita datenrendimento: 20 Gb/provaĵo (Laŭ specio)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Plenlongaj neĥimeraj transciptoj
Bioinformadikaj analizoj
● Kruda datumtraktado
● Transskriba identigo
● Sekvenca strukturo
● Esprima Kvantigo
● Funkcia Komentario
Specimenaj Postuloj kaj Livero
Ekzemplaj Postuloj:
Nukleotidoj:
| Konk. (ng/μl) | Kvanto (μg) | Pureco | Integreco |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Limigita aŭ neniu proteino aŭ DNA-poluado montrita sur ĝelo. | Por plantoj: RIN≥7.5; Por bestoj: RIN≥8.0; 5.0≥ 28S/18S≥1.0; limigita aŭ neniu bazlinia alteco |
Histo: Pezo (seka):≥1 g
*Por histo pli malgranda ol 5 mg, ni rekomendas sendi fulmfrostitan (en likva nitrogeno) histo-provaĵo.
Ĉela suspendo:Ĉelkalkulo = 3×106- 1×107
*Ni rekomendas sendi frostitan ĉelan lizaton.Se tiu ĉelo nombras pli malgranda ol 5×105, fulmo frostigita en likva nitrogeno rekomendas, kio estas preferinda por mikro eltiro.
Sangaj specimenoj:Volumo ≥1 ml
Mikroorganismo:Maso ≥ 1 g
Rekomendita Specimena Livero
Ujo:
2 ml centrifuga tubo (Stana folio ne rekomendas)
Ekzempla etikedado: Grupo+replikato ekz. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Sendado:
1. Seka glacio: Specimenoj devas esti pakitaj en sakoj kaj enterigitaj en seka glacio.
2. RNAstable-tuboj: RNA-provaĵoj povas esti sekigitaj en RNA-stabiliga tubo (ekz. RNAstable®) kaj senditaj en ĉambra temperaturo.
Serva Laborfluo
Eksperimenta dezajno
Specimena livero
RNA-eltiro
Bibliotekokonstruo
Sekvencado
Analizo de datumoj
Post-vendaj servoj
1.FLNC-longa distribuo
Longo de plenlonga ne-ĥimera legado (FLNC) indikas longon de cDNA en bibliotekkonstruo.FLNC-longdistribuo estas decida indikilo en taksado de kvalito de bibliotekkonstruo.
FLNC legi longodistribuon
2.Kompleta ORF-regiona longodistribuo
Ni uzas TransDecoder por antaŭdiri proteinajn kodigajn regionojn kaj respondajn aminoacidajn sekvencojn por generi unigenajn arojn, kiuj enhavas kompletajn ne-redungajn transskribajn informojn en ĉiuj specimenoj.
Kompleta ORF-regionlongodistribuo
3.KEGG-voja pliriĉiga analizo
Diference esprimitaj transskribaĵoj (DEToj) povas esti identigitaj vicigante NGS-bazitajn RNA-sekvencdatenojn pri plenlongaj transskribaĵoj generitaj per PacBio-sekvencaj datenoj.Tiuj DEToj povas plue prilaboritaj por diversaj funkcia analizo, ekz. KEGG-pada riĉiga analizo.
DET KEGG-voja riĉigo -Punkto-intrigo
Kazo BMK
La evolua dinamiko de la Populus-tiga transcriptome
Eldonita: Plant Biotechnology Journal, 2019
Sekvenca strategio:
Ekzempla kolekto:tigo regionoj: apekso, unua internodo (IN1), dua internodo (IN2), tria internodo (IN3), internodo (IN4) kaj internodo (IN5) de Nanlin895
NGS-sekvenco:RNA de 15 individuoj estis kunigita kiel unu biologia provaĵo.Tri biologiaj kopioj de ĉiu punkto estis prilaboritaj por NGS-sekvenco
TGS-sekvenco:Tigaj regionoj estis dividitaj en tri regionojn, te apekso, IN1-IN3 kaj IN4-IN5.Ĉiu regiono estis prilaborita por PacBio-sekvencado kun kvar specoj de bibliotekoj: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb kaj 3-10 kb.
Ŝlosilaj rezultoj
1.Entute 87150 plenlongaj transskribaĵoj estis identigitaj, en kiuj, 2081 novaj izoformoj kaj 62058 novaj alternativaj splisitaj izoformoj estis identigitaj.
2.1187 lncRNA kaj 356 fuziogenoj estis identigitaj.
3.De primara kresko ĝis sekundara kresko, 15838 diferencige esprimitaj transskribaĵoj de 995 diferencige esprimitaj genoj estis identigitaj.En ĉiuj DEGoj, 1216 estis transkripcifaktoroj, la plej granda parto de kiuj ankoraŭ ne estis raportita.
4.GO-riĉiga analizo malkaŝis gravecon de ĉela divido kaj oksidig-redukta procezo en primara kaj malĉefa kresko.
Alternativaj splisaj eventoj kaj malsamaj izoformoj
WGCNA-analizo pri transkripcifaktoroj
Referenco
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.La evolua dinamiko de la Populus-tiga transcriptome.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
