ΑΠΑΙΤΗΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΓΟΝΙΔΩΜΑΤΟΣ
Η γονιδιωματική παρακολούθηση του SARS-CoV-2 αποκαλύπτει μια παραλλαγή διαγραφής Nsp1 που ρυθμίζει την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι
Nanopore |Illumina |Αναδιάταξη ολόκληρου του γονιδιώματος |μεταγονιδιωματική |RNA-Seq |Sanger
Η Biomarker Technologies παρείχε τεχνική υποστήριξη για την αλληλουχία δειγμάτων σε αυτή τη μελέτη.
Καλύτερες στιγμές
1. Η αλληλουχία του γονιδιώματος SARS-CoV-2 και η φυλογνητική ανάλυση εντοπίζουν 35 επαναλαμβανόμενες μεταλλάξεις, συμπεριλαμβανομένων 31 SNPs και 4 Indels.
2. Η συσχέτιση με 117 κλινικούς φαινότυπους αποκαλύπτει δυνητικά
σημαντικές μεταλλάξεις.
Το Δ500-532 στην κωδικοποιητική περιοχή Nsp1 συσχετίζεται με χαμηλότερο ιό
3.φορτίο και IFN-β ορού.
4. Τα απομονωμένα στελέχη ιών με μετάλλαξη Δ500-532 επάγουν χαμηλότερη IFN-I
απάντηση στα μολυσμένα κύτταρα.
Πειραματικό σχέδιο
Επιτεύγματα
1. Επιδημιολογική και γονιδιωματική επιτήρηση COVID-19
Τα κλινικά δεδομένα συλλέχθηκαν στην επαρχία Σιτσουάν της Κίνας κατά την περίοδο της επιδημίας από τις 22 Ιανουαρίου 2020 έως τις 20 Φεβρουαρίου 2020. Συνολικά 538 περιπτώσεις COVID-19 επιβεβαιώθηκαν με τεστ qPCR στο Σιτσουάν, το 28,8% των οποίων ήταν από την επαρχία κεφάλαιο.Τα επιβεβαιωμένα κρούσματα στο Σιτσουάν αυξήθηκαν εκθετικά, κορυφώνοντας στις 30 Ιανουαρίου.Επίσης, τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι η κοινωνική απόσταση μπορεί να είναι βασικός παράγοντας για την πρόληψη της εξάπλωσης του ιού.
Εικόνα 1. Επιδημιολογική μελέτη του COVID-19 στην επαρχία Σιτσουάν, Κίνα
2. Κατασκευή γονιδιώματος SARS-CoV-2 και ταυτοποίηση παραλλαγών
Με πολλαπλή ενίσχυση PCR ακολουθούμενη από αλληλούχιση νανοπόρου, δημιουργήθηκαν συνολικά 310 σχεδόν ή μερικώς πλήρη γονιδιώματα από 248 ασθενείς με περίπου.Το 80% των γονιδιωμάτων καλύπτεται από 10 αναγνώσεις (Μέσο βάθος: 0,39 M αναγνώσεις ανά δείγμα).
Σχήμα 2. Συχνότητα κάθε παραλλαγής στην κοόρτη Σιτσουάν
Συνολικά 104 SNPs και 18 Indels ταυτοποιήθηκαν από γονιδιώματα SARS-CoV-2, στα οποία 31 SNPs και 4 Indels ταυτοποιήθηκαν ως υποτροπιάζουσες γενετικές παραλλαγές.Συγκρίνοντάς τα με 169 δείγματα από τη Γουχάν και με 81.391 υψηλής ποιότητας αλληλουχίες δημόσιου γονιδιώματος στο GISAID, 29 από τις 35 παραλλαγές που βρέθηκαν και παρουσιάζονται σε άλλες ηπείρους.Συγκεκριμένα, τέσσερις παραλλαγές, συμπεριλαμβανομένων των ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 και T13243C, βρέθηκαν να παρουσιάζονται μόνο στο Σιτσουάν και στο Γουχάν και απουσιάζουν στα δεδομένα GISAID, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι παραλλαγές ήταν πολύ πιθανό να προέκυπταν από τη Γουχάν, οι οποίες πληρούν τις ταξιδιωτικά αρχεία ασθενών.
Η εξελικτική ανάλυση με τη μέθοδο μέγιστης πιθανότητας (ML) και τις προσεγγίσεις μοριακού ρολογιού Bayesian υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε 88 νέους ιούς από το Σιτσουάν και 250 επιμελημένα γονιδιώματα από άλλες περιοχές.Γονιδιώματα με Δ500-532 (Διαγραφές στην περιοχή κωδικοποίησης Nsp1) βρέθηκαν αραιά κατανεμημένα στο φυλογενετικό δέντρο.Η ανάλυση απλότυπου σε παραλλαγές Nsp1 εντόπισε 5 από αυτές από πολλές πόλεις.Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το Δ500-532 εμφανίστηκε σε πολλές πόλεις και μπορεί να εισαχθεί πολλές φορές από το Wuhan.
Εικόνα 2. Επαναλαμβανόμενες γενετικές παραλλαγές και φυλογενετική ανάλυση στα γονιδιώματα SARS-CoV-2
3. Συσχέτιση επαναλαμβανόμενων γενετικών παραλλαγών με κλινικές επιπτώσεις
117 κλινικοί φαινότυποι συσχετίστηκαν με τη σοβαρότητα του COVID-19, όπου 19 φαινότυποι που σχετίζονται με τη σοβαρότητα ταξινομήθηκαν σε σοβαρά και μη σοβαρά χαρακτηριστικά.Η σχέση μεταξύ αυτών των χαρακτηριστικών και 35 επαναλαμβανόμενων γενετικών παραλλαγών αναπτύχθηκε σε χάρτη θερμότητας δύο συστάδων.Μια ανάλυση εμπλουτισμού κατάταξης τύπου GSEA έδειξε ότι το Δ500-532 συσχετίζεται αρνητικά με τον αριθμό των Τ κυττάρων ESR, της IFN-β ορού και του CD3+CD8+ στο αίμα.Επιπλέον, οι δοκιμές qPCR έδειξαν ότι οι ασθενείς που είχαν μολυνθεί με ιό που φέρει Δ500-532 είχαν την υψηλότερη τιμή Ct, δηλαδή το χαμηλότερο ιικό φορτίο.
Εικόνα 3. Συσχετίσεις 35 υποτροπιάζοντων γενετικών παραλλαγών με κλινικούς φαινότυπους
4. Επικύρωση κλινικών φαινοτύπων που σχετίζονται με ιικές μεταλλάξεις
Προκειμένου να κατανοηθούν οι επιδράσεις του Δ500-532 στις λειτουργίες Nsp1, τα κύτταρα HEK239T επιμολύνθηκαν με πλασμίδια που εκφράζουν πλήρους μήκους, WT Nsp1 και μεταλλαγμένες μορφές με διαγραφές.Τα προφίλ μεταγραφώματος κάθε επεξεργασμένου κυττάρου HEK239T υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση PCA, δείχνοντας ότι τα μεταλλάγματα διαγραφής συγκεντρώθηκαν σχετικά πιο κοντά και ήταν σημαντικά διαφορετικά από το WT Nsp1.Τα γονίδια που ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω στα μεταλλάγματα εμπλουτίστηκαν κυρίως σε «πεπτιδική βιοσυνθετική/μεταβολική διεργασία», «βιογένεση συμπλόκου ριβονουκλεοπρωτεϊνών», «στόχευση πρωτεϊνών στη μεμβράνη/ER» κ.λπ. Επιπλέον, δύο διαγραφές έδειξαν ένα διακριτό μοτίβο επέκτασης από το WT.
Σχήμα 4. Ανάλυση μεταγραφών σε κύτταρα HEK239T που επιμολύνθηκαν από WT Nsp1 και αυτό με διαγραφές
Οι επιδράσεις των διαγραφών στην απόκριση της IFN-1 δοκιμάστηκαν επίσης σε υπερεκφρασμένη μελέτη.Όλες οι δοκιμασμένες διαγραφές φάνηκε ότι μειώνουν την ανταπόκριση της IFN-1 σε επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ239Τ και Α549 τόσο σε επίπεδο μεταγραφώματος όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης.Είναι ενδιαφέρον ότι τα σημαντικά μειωμένα γονίδια στις διαγραφές εμπλουτίστηκαν σε «αμυντική απόκριση στον ιό», «αντιγραφή ιικού γονιδιώματος», «ρύθμιση μεταγραφής από RNA πολυμεράση II» και «απόκριση στην ιντερφερόνη τύπου Ι».
Εικόνα 5. Καθοδική ρύθμιση των μονοπατιών σηματοδότησης ιντερφερόνης σε μεταλλαγμένο Δ500-532
Σε αυτή τη μελέτη, η επίδραση αυτών των διαγραφών στον ιό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από μελέτες ιογενών λοιμώξεων.Ιοί με ορισμένα μεταλλάγματα απομονώθηκαν από κλινικά δείγματα και μολύνθηκαν σε κύτταρα Calu-3.Λεπτομερή αποτελέσματα σχετικά με τη μελέτη ιογενούς λοίμωξης μπορείτε να διαβάσετε στο έγγραφο.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Αναφορά
Lin J, Tang C, Wei Η, et αϊ.Η γονιδιωματική παρακολούθηση του SARS-CoV-2 αποκαλύπτει μια παραλλαγή διαγραφής Nsp1 που ρυθμίζει την απόκριση ιντερφερόνης τύπου Ι[J].Κυτταρικός ξενιστής και μικρόβιο, 2021.
Νέα και Στιγμιότυπα στοχεύει στο να μοιράζεται τις πιο πρόσφατες επιτυχημένες περιπτώσεις με τη Biomarker Technologies, αποτυπώνοντας νέα επιστημονικά επιτεύγματα καθώς και εξέχουσες τεχνικές που εφαρμόστηκαν κατά τη διάρκεια της μελέτης.
Ώρα δημοσίευσης: Ιαν-06-2022