Neusequenzierung des gesamten Genoms
Die genomische Überwachung von SARS-CoV-2 deckt eine Nsp1-Deletionsvariante auf, die die Typ-I-Interferon-Reaktion moduliert
Nanopore |Illumina |Resequenzierung des gesamten Genoms |Metagenomik |RNA-Seq |Sänger
Biomarker Technologies leistete in dieser Studie technische Unterstützung bei der Probensequenzierung.
Höhepunkte
1. SARS-CoV-2-Genomsequenzierung und phylogenetische Analyse identifizieren 35 wiederkehrende Mutationen, darunter 31 SNPs und 4 Indels.
2. Die Assoziation mit 117 klinischen Phänotypen zeigt Potenzial auf
wichtige Mutationen.
∆500-532 in der Nsp1-kodierenden Region korreliert mit niedrigerem Viruswert
3.Beladung und Serum-IFN-β.
4. Virusisolate mit der Mutation ∆500-532 induzieren einen niedrigeren IFN-I-Wert
Reaktion in den infizierten Zellen.
Experimentelles Design
Erfolge
1. Epidemiologische und genomische Überwachung von COVID-19
Klinische Daten wurden in der chinesischen Provinz Sichuan während des Ausbruchszeitraums vom 22. Januar 2020 bis 20. Februar 2020 gesammelt. Insgesamt 538 COVID-19-Fälle wurden durch qPCR-Tests in Sichuan bestätigt, 28,8 % davon stammten aus der Provinz Hauptstadt.Bestätigte Fälle in Sichuan nahmen exponentiell zu und erreichten am 30. Januar ihren Höhepunkt.Außerdem belegen die Daten, dass soziale Distanzierung ein Schlüsselfaktor bei der Verhinderung der Virusausbreitung sein kann.
Abbildung 1. Epidemiologische Studie zu COVID-19 in der Provinz Sichuan, China
2. Konstruktion des SARS-CoV-2-Genoms und Identifizierung von Varianten
Mit Multiplex-PCR-Amplifikation und anschließender Nanoporensequenzierung wurden insgesamt 310 nahezu oder teilweise vollständige Genome von 248 Patienten mit ca.80 % der Genome werden durch 10 Reads abgedeckt (mittlere Tiefe: 0,39 M Reads pro Probe).
Abbildung 2. Häufigkeit der einzelnen Varianten in der Sichuan-Kohorte
Insgesamt wurden 104 SNPs und 18 Indels aus SARS-CoV-2-Genomen identifiziert, wobei 31 SNPs und 4 Indels als wiederkehrende genetische Varianten identifiziert wurden.Durch den Vergleich mit 169 Proben aus Wuhan und mit 81.391 hochwertigen öffentlichen Genomsequenzen in GISAID wurden 29 der 35 gefundenen Varianten auf anderen Kontinenten präsentiert.Bemerkenswerterweise wurden vier Varianten, darunter ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 und T13243C, nur in Sichuan und Wuhan gefunden und fehlten in den GISAID-Daten, was darauf hindeutet, dass diese Varianten sehr wahrscheinlich aus Wuhan importiert wurden, die die Anforderungen erfüllen Reiseaufzeichnungen von Patienten.
Eine evolutionäre Analyse mit der Maximum-Likelihood-Methode (ML) und Bayes'schen Molekularuhr-Ansätzen wurde an 88 neuen Viren aus Sichuan und 250 kuratierten Genomen aus anderen Regionen durchgeführt.Genome mit ∆500–532 (Deletionen in der Nsp1-Kodierungsregion) wurden im phylogenetischen Baum spärlich verteilt gefunden.Die Haplotypanalyse der Nsp1-Varianten identifizierte fünf davon aus mehreren Städten.Diese Ergebnisse legen nahe, dass der ∆500-532 in mehreren Städten auftrat und möglicherweise mehrmals aus Wuhan importiert wurde.
Abbildung 2. Wiederkehrende genetische Varianten und phylogenetische Analyse im SARS-CoV-2-Genom
3. Zusammenhang wiederkehrender genetischer Varianten mit klinischen Implikationen
117 klinische Phänotypen waren mit dem Schweregrad von COVID-19 verbunden, wobei 19 mit dem Schweregrad zusammenhängende Phänotypen in schwere und nicht schwere Merkmale eingeteilt wurden.Die Beziehung zwischen diesen Merkmalen und 35 wiederkehrenden genetischen Varianten wurde in einer Bi-Cluster-Heatmap visualisiert.Eine GSEA-ähnliche Rangfolge-Anreicherungsanalyse zeigte, dass ∆500-532 negativ mit der ESR, der Serum-IFN-β- und der CD3+CD8+-T-Zellzahl im Blut korreliert.Darüber hinaus zeigten qPCR-Tests, dass Patienten, die mit einem Virus mit ∆500-532 infiziert waren, den höchsten Ct-Wert, also die niedrigste Viruslast, aufwiesen.
Abbildung 3. Assoziationen von 35 wiederkehrenden genetischen Varianten mit klinischen Phänotypen
4. Validierung viraler mutationsassoziierter klinischer Phänotypen
Um die Auswirkungen von ∆500-532 auf die Nsp1-Funktionen zu verstehen, wurden HEK239T-Zellen mit Plasmiden transfiziert, die Nsp1 in voller Länge, WT-Nsp1 und mutierte Formen mit Deletionen exprimierten.Transkriptomprofile jeder behandelten HEK239T-Zellen wurden für die PCA-Analyse verarbeitet und zeigten, dass Deletionsmutanten relativ dicht beieinander lagen und sich signifikant von WT Nsp1 unterschieden.Die Gene, die in den Mutanten signifikant hochreguliert waren, waren hauptsächlich in den Bereichen „Peptidbiosynthese-/Stoffwechselprozess“, „Ribonukleoproteinkomplex-Biogenese“, „Protein-Targeting auf Membran/ER“ usw. angereichert. Darüber hinaus zeigten zwei Deletionen ein deutliches Expressionsmuster von WT.
Abbildung 4. Transkriptomanalyse von HEK239T-Zellen, die mit WT Nsp1 und solchen mit Deletionen transfiziert wurden
Die Auswirkungen von Deletionen auf die IFN-1-Reaktion wurden auch in einer Überexpressionsstudie getestet.Es wurde gezeigt, dass alle getesteten Deletionen die IFN-1-Reaktion in transfizierten HEK239T- und A549-Zellen sowohl auf Transkriptomebene als auch auf Proteinebene verringern.Interessanterweise waren die deutlich herunterregulierten Gene in den Deletionen angereichert in den Bereichen „Abwehrreaktion auf Viren“, „virale Genomreplikation“, „Regulierung der Transkription durch RNA-Polymerase II“ und „Reaktion auf Typ-I-Interferon“.
Abbildung 5. Herunterregulierung der Interferon-Signalwege in der ∆500-532-Mutante
In dieser Studie wurde der Einfluss dieser Deletionen auf das Virus durch Virusinfektionsstudien weiter bestätigt.Viren mit bestimmten Mutanten wurden aus klinischen Proben isoliert und Calu-3-Zellen infiziert.Detaillierte Ergebnisse zur Virusinfektionsstudie können in der Arbeit nachgelesen werden.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referenz
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Die genomische Überwachung von SARS-CoV-2 deckt eine Nsp1-Deletionsvariante auf, die die Typ-I-Interferon-Reaktion moduliert[J].Zellwirt und Mikrobe, 2021.
Neuigkeiten und Highlights Ziel ist es, die neuesten erfolgreichen Fälle mit Biomarker-Technologien zu teilen und neue wissenschaftliche Errungenschaften sowie herausragende Techniken, die während der Studie angewendet wurden, zu erfassen.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 06.01.2022