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DNA/RNA-Sequenzierung – PacBio Sequencer

Die PacBio-Sequenzierungsplattform ist eine Long-Read-Sequenzierungsplattform, die auch als eine der TGS-Technologien (Third-Generation Sequencing) bekannt ist.Die Kerntechnologie Single-Molecule Real-Time (SMRT) ermöglicht die Generierung von Lesevorgängen mit einer Länge von mehreren zehn Kilobasen.Auf der Grundlage von „Sequencing-by-Synthesis“ wird die Auflösung einzelner Nukleotide durch einen Zero-Mode-Wellenleiter (ZMW) erreicht, bei dem nur ein begrenztes Volumen am Boden (Ort der Molekülsynthese) beleuchtet wird.Darüber hinaus vermeidet die SMRT-Sequenzierung weitgehend sequenzspezifische Verzerrungen im NGS-System, da die meisten PCR-Amplifikationsschritte im Bibliothekskonstruktionsprozess nicht erforderlich sind.

Plattform: Sequel II, Revio

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Servicedetails

Demo-Ergebnisse

Merkmale

Zwei Sequenzierungsmodi auf dem PacBio-Sequenzer: Continuous Long Read (CLR) und Circular Consensus Read (CCS)

Sequenzierungsmodus

Bibliotheksgröße

Theoretische DatenErtrag (pro Zelle)

EinzelbasisGenauigkeit

Anwendungen

CLR

20 KB, 30 KB usw.

80 GB bis 130 GB

Ca.85 %

De novo, SV-Anrufe usw.

CCS

15-20 KB

14 bis 40 GB/Zelle (Sequel II)

70 bis 110 Gbit/s (Revio)

Hängt von den Proben ab

Ca.99 %

De novo, SNP/Indel/SV-Aufruf, Iso-Seq,

Vergleich der Leistung und Funktionen von Revio und Sequel II

Bedingungen	Sequel II-System	Revio-System	Zunahme
Höhere Dichte	8 Millionen ZMWs	25 Millionen ZMWs	3x
Unabhängige Bühnen	1	4	4x
Kürzere Laufzeiten	30 Stunden	24 Stunden	1,25x
30X HiFi-Humangenome pro Jahr	88	1.300	1Insgesamt 5x

Servicevorteile

● Über 8 Jahre Erfahrung auf der PacBio-Sequenzierungsplattform mit Tausenden abgeschlossenen Projekten mit verschiedenen Arten.

● Vollständig ausgestattet mit den neuesten PacBio-Sequenzierungsplattformen, Revio, um einen ausreichenden Sequenzierungsdurchsatz zu gewährleisten.

● Schnellere Bearbeitungszeit, höhere Datenausbeute und genauere Daten.

● Beiträge zu Hunderten von einflussreichen PacBio-basierten Publikationen.

Beispielanforderungen

Beispielstyp

Menge

Konzentration (Qubit®)

Volumen

Reinheit

Andere

Genomische DNA

Abhängig von den Datenanforderungen

≥50 ng/μl

≥15μl

OD260/280=1,7-2,2;
OD260/230=1,8-2,5；
Klarer Peak bei 260 nm,keine Verunreinigungen

Die Konzentration muss mit Qubit und Qubit/Nanopore = 0,8–2,5 gemessen werden

Gesamt-RNA

≥1,2μg

≥120 ng/μl

≥15μl

OD260/280=1,7-2,5;
OD260/230=0,5-2,5；keine Verunreinigungen

RIN-Wert ≥7,5

5≥28S/18S≥1

Service-Workflow

Probenvorbereitung

Bibliotheksbau

Sequenzierung

Datenanalyse

Projektabwicklung

Vorherige: OEM-Hersteller Mrna Sequencing Service – Lange nichtkodierende Sequenzierung – Illumina – Biomarker

Nächste: Illumina und BGI

1. Interner Datenertrag

Daten generiert aus 63 CCS-Zellen (von 26 Arten)

DATEN-PacBio-CCS-15 Kb	Durchschnitt	Max	Mindest	Median
Ertrag – Subreads (GB)	421.12	544,27	221,38	426,58
Yield - CCS(Gb)	25.93	38,59	10.86	25.43
Polymerase N50	145.651	175.430	118.118	144.689
Untertitel N50	17.509	23.924	12.485	17.584
CCS N50	14.490	19.034	9.876	14.747
Durchschnittliche Länge-Polymerase	67.995	89.379	49.664	66.433
Durchschnittliche Länge – Subreads	15.866	21.036	11.657	16.012
Durchschnittliche Länge-CCS	14.489	19.074	8.575	14.655

Daten generiert aus 16 CLR-Zellen (von 76 Arten)

DATA-PacBio-CLR-30Kb	Durchschnitt	Max	Mindest	Median
Ertrag – Subreads (GB)	142,20	291,40	50,55	142,49
Polymerase N50	39.456	121.191	15.389	35.231
Untertitel N50	28.490	41.012	14.430	29.063
Durchschnittliche Länge-Polymerase	22.063	48.886	8.747	21.555
Durchschnittliche Länge – Subreads	17.720	27.225	8.293	17.779

2.Daten-QC – DemoStatistiken zum Datenertrag

Probe	ccs Liest Num	Gesamte CCS-Basen (bp)	ccs Liest N50 (bp)	ccs Mittlere Länge (bp)	ccs Längster Lesevorgang (bp)	Subreads Basen (bp)	CCS-Rate (%)
PB_BMKxxx	3.444.159	54.164.122.586	15.728	15.726	36.110	863.326.330.465	6.27