METAGENOMI
Komplette, lukkede bakterielle genomer fra mikrobiomer ved hjælp af nanopore-sekventering
Nanopore-sekventering |Metagenomics |MAG'er |Bakteriel genom cirkularisering |Tarmmikrobiota
Højdepunkter
1. En ny metode til at ekstrahere lange fragmenter af DNA blev præsenteret i denne undersøgelse, som opnåede ekstraktion af mikrogram rent HMW DNA egnet til langlæst sekventering fra 300 mg afføring
2. En monteringsarbejdsgang, Drejebænk, blev introduceret i denne undersøgelse, hvor MAG'er blev samlet ved lange læsninger og korrigeret ved korte læsninger.
3. Drejebænk blev evalueret ved falsk blanding.7 ud af 12 bakterier blev samlet med succes til enkelte contigs og 3 blev samlet til fire eller færre contigs.
4. Drejebænk blev yderligere påført til afføringsprøver, som genererede 20 cirkulære genomer, inklusive Prevotella copri og kandidat Cibiobacter sp., som var kendt for at være rige på mobile genetiske elementer.
Hovedpræstation
Ekstraktionsprotokol for HWM DNA
Langlæste sekventeringsbaserede tarmmetagenomiske undersøgelser har længe været ramt af hårdhed ved ekstraktion af højmolekylært (HMW) DNA fra afføring.I denne undersøgelse blev en enzymbaseret ekstraktionsprotokol introduceret for at undgå omfattende klipning ved perleslag i traditionelle metoder.Som vist i den følgende figur blev prøverne først behandlet med en cocktail af enzymer, herunder lytisk enzym, MetaPolyzyme osv. for at nedbryde cellevægge.Frigivet DNA blev ekstraheret med phenol-chloroform-system, efterfulgt af Proteinase K- og RNase A-fordøjelse, søjlebaseret oprensning og SPRI-størrelsesudvælgelse.Denne metode formåede at give mikrogram HMW DNA fra 300 m afføring, som opfylder krav til langaflæst sekventering både med hensyn til kvalitet og kvantitet.
Figur 1. HWM DNA-ekstraktionsskema
Skema flow af drejebænk
Som beskrevet i den følgende figur indeholder drejebænken eksisterende proces med rå basecalling-proces ved hjælp af Guppy.To langaflæste samlinger produceres derefter af Flye og Canu separat efterfulgt af fejlmontering og fjernelse.De to underenheder er slået sammen med quickmerge.Ved sammenlægning kontrolleres store samlinger på megabase-niveau for cirkularisering.Efterfølgende behandles konsensusforfining om disse forsamlinger med korte læsninger.De endelige samlede bakterielle genomer behandles til endelig påvisning og fjernelse af fejlsamling.
Figur 2. Skema flow af drejebænk samling
Evaluering af drejebænk med mock bakterieblanding
En standard ATCC 12-arter blanding omfattende både Gram-positive og Gram-negative bakterier blev anvendt til at evaluere ydeevnen af nanopore sekventeringsplatform og drejebænk i MAG samling.I alt 30,3 Gb data blev genereret af nanopore platform med N50 på 5,9 kb.Drejebænk forbedrede stort set samling N50 til 1,6 til 4 gange sammenlignet med andre langlæste samleværktøjer og 2 til 9 gange sammenlignet med hybride samleværktøjer.Af 12 bakterielle genomer blev syv samlet i enkelte contigs (figur 3. Circos med sort prik).Tre mere blev samlet i fire eller færre contigs, hvor den mest ufuldstændige samling indeholdt 83% af genomet i en enkelt contig.
Figur 3. Genomsamlinger i en defineret 12-arter bakteriel blanding
Anvendelse af drejebænk i afføringsprøver
Denne metode blev yderligere anvendt på humane afføringsprøver for at sammenligne organismeidentifikation og samlingssammenhæng med eksisterende metoder, read-cloud og kortlæsningsbaseret analyse.Fra de tre involverede prøver gav den nye enzymbaserede ekstraktion mindst 1 μg pr. 300 mg inputmasse.Nanopore-sekventering af disse HMW-DNA genererede long-reads med N50 på henholdsvis 4,7 kb, 3,0 kb og 3,0 kb.Navnlig viste den nuværende metode stort potentiale i mikrobiel detektion sammenlignet med eksisterende metoder.Relativt højere alfa-diversitet på artsniveau blev vist her sammenlignet med kortlæsning og læsesky.Desuden blev alle slægter fra kortlæst analyse, selv typisk lysis-resistente gram-positive organismer, genvundet ved denne metode.
Figur 4. Alfa-diversitet og taksanomiske komponenter bestemt af Nanopore, short-read og read-cloud metoder
Drejebænken gav meget længere hel-samling N50 end kort-læse og læse-cloud samling, på trods af en tre- til seks gange lavere input af rådata.Draft genomer blev produceret ved contig binning, hvor udkastene blev klassificeret i "høj kvalitet" eller "delvis" baseret på fuldstændighed, kontaminering, enkeltkopi kernegener osv. Langlæst samling viste meget højere sammenhæng til lavere omkostninger sammenlignet med at kortlæse og læse-sky.
Figur 5. Sammenhæng pr. organisme for hver metode
Desuden er den nuværende samlingstilgang i stand til at give lukkede, cirkulære genomer.I afføringsprøverne blev otte enkelt-kontig genomer af høj kvalitet samlet, og fem af disse opnåede præcis cirkularisering.Langlæst tilgang viste også imponerende kapacitet til at løse gentagne elementer i genomer.CirkulariseretP. coprigenomet blev genereret ved denne tilgang, som har været kendt for at indeholde høj grad af sekvensgentagelse.Den bedste samling af dette genom ved kortlæsning og read-cloud oversteg aldrig N50 på 130 kb, selv med en dækningsdybde på 4800X.Disse høje kopiantal-elementer blev fuldt ud løst ved langlæsningstilgang, som ofte findes ved brudpunkter for kortlæsnings- eller læsesky-samlinger.Et andet lukket genom blev rapporteret i denne undersøgelse, som blev antaget at være medlem af nyligt beskrevetCibiobakterclade.Fem formodede fager blev identificeret i denne lukkede samling, varierende fra 8,5 til 65,9 kb.
Figur 6. Circosdiagram af lukkede genomer af P.copri og Cibiobacter sp.
Reference
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Komplette, lukkede bakterielle genomer fra mikrobiomer ved hjælp af nanopore-sekventering.Natur bioteknologi,38(6), 701-707.
Teknologi og højdepunkter sigter på at dele den seneste succesfulde anvendelse af forskellige high-throughput sekventeringsteknologier i forskellige forskningsarenaer samt geniale ideer inden for eksperimentelt design og datamining.
Indlægstid: Jan-07-2022