HELE GENOMET RESEKVENTION
Genomisk overvågning af SARS-CoV-2 afslører en Nsp1 deletionsvariant, der modulerer type I interferonrespons
Nanopore |Illumina |Resekventering af hele genomet |metagenomics |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies ydede teknisk support til prøvesekventering i denne undersøgelse.
Højdepunkter
1.SARS-CoV-2 genomsekventering og fylogenetisk analyse identificerer 35 tilbagevendende mutationer, herunder 31 SNP'er og 4 Indels.
2.Association med 117 kliniske fænotyper afslører potentielt
vigtige mutationer.
∆500-532 i Nsp1-kodende region korrelerer med lavere viral
3.belastning og serum IFN-β.
4.Virale isolater med ∆500-532 mutation inducerer lavere IFN-I
respons i de inficerede celler.
Eksperimentelt design
Præstationer
1. COVID-19 epidemiologisk og genomisk overvågning
Kliniske data blev indsamlet i Sichuan-provinsen, Kina i hele udbrudsperioden fra 22. januar 2020 til 20. februar 2020. I alt 538 COVID-19-tilfælde blev bekræftet af qPCR-test i Sichuan, hvoraf 28,8 % var fra provinsen kapital.Bekræftede tilfælde i Sichuan steg eksponentielt og toppede den 30. januar.Data understøttede også, at social distancering kan være en nøglefaktor for at forhindre virusspredning.
Figur 1. Epidemiologisk undersøgelse af COVID-19 i Sichuan-provinsen, Kina
2. SARS-CoV-2 genomkonstruktion og variantidentifikation
Med multipleks PCR-amplifikation efterfulgt af nanopore-sekventering blev der genereret i alt 310 næsten eller delvist komplette genomer fra 248 patienter med ca.80 % af genomerne dækket af 10 aflæsninger (gennemsnitlig dybde: 0,39 M aflæsninger pr. prøve).
Figur 2. Hyppighed af hver variant i Sichuan-kohorten
I alt 104 SNP'er og 18 Indels blev identificeret fra SARS-CoV-2-genomer, hvor 31 SNP'er og 4 Indels blev identificeret som tilbagevendende genetiske varianter.Ved at sammenligne dem med 169 prøver fra Wuhan og med 81.391 højkvalitets publich genom-sekvenser i GISAID, præsenteres 29 af de 35 varianter fundet på andre kontinenter.Navnlig blev fire varianter, herunder ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 og T13243C, kun fundet til stede i Sichuan og Wuhan og fraværende i GISAID-data, hvilket indikerer, at disse varianter med stor sandsynlighed ville blive impoteret fra Wuhan, som opfylder rejsejournaler for patienter.
Evolutionær analyse med maksimal sandsynlighed (ML) metode og Bayesianske molekylære ur tilgange blev behandlet på 88 nye virus s fra Sichuan og 250 kuraterede genomer fra andre regioner.Genomer med ∆500-532 (deletioner i Nsp1-kodende region) blev fundet spredt spredt i det fylogenetiske træ.Haplotypeanalyse på Nsp1-varianter identificerede 5 af dem fra flere byer.Disse resultater antydede, at ∆500-532 fandt sted i flere byer og kunne importeres flere gange fra Wuhan.
Figur 2. Tilbagevendende genetiske varianter og fylogenetisk analyse i SARS-CoV-2-genomerne
3. Sammenslutning af tilbagevendende genetiske varianter med kliniske implikationer
117 kliniske fænotyper var forbundet med COVID-19 sværhedsgrad, hvor 19 sværhedsgradsrelaterede fænotyper blev klassificeret i svære og ikke-alvorlige træk.Forholdet mellem disse træk og 35 tilbagevendende genetiske varianter blev viualiseret i bi-cluster heatmap.En GSEA-lignende rangeret berigelsesanalyse viste, at ∆500-532 er negativt korreleret med ESR, serum IFN-β og CD3+CD8+ T-celletal i blodet.Ydermere viste qPCR-test, at patienter inficeret med virus indeholdende ∆500-532 havde den højeste Ct-værdi, dvs. laveste viral load.
Figur 3. Associationer af 35 tilbagevendende genetiske varianter med kliniske fænotyper
4. Validering af viral mutationsassocierede kliniske fænotyper
For at forstå virkningerne af ∆500-532 på Nsp1-funktioner blev HEK239T-celler transficeret med plasmider, der udtrykker fuld-længde, WT Nsp1 og mutantformer med deletioner.Transkriptomprofiler af hver behandlede HEK239T-celler blev behandlet til PCA-analyse, hvilket viste, at deletionsmutanter klyngede sig relativt tættere og var signifikant forskellige fra WT Nsp1.De gener, der var signifikant opreguleret i mutanterne, var hovedsageligt beriget i "peptid biosyntetisk/metabolisk proces", "ribonukleoprotein kompleks biogenese", "protein targeting to membrane/ER", etc. Desuden viste to deletioner et distinkt ekspressionsmønster fra WT.
Figur 4. Transkriptomanalyse på HEK239T-celler transficeret af WT Nsp1 og det med deletioner
Virkningerne af deletioner på IFN-1-respons blev også testet i overudtrykt undersøgelse.Alle testede deletioner blev vist at reducere IFN-1-repsonse i transficerede HEK239T- og A549-celler på både transkriptomniveau og proteinniveau.Interessant nok blev de signifikant nedregulerede gener i deletioner beriget i "forsvarsrespons på virus", "viral genomreplikation", "regulering af transkription af RNA-polymerase II" og "respons på type I-interferon".
Figur 5. Nedregulering af interferon signalveje i ∆500-532 mutant
I denne undersøgelse blev virkningen af disse deletioner på virus yderligere bekræftet af virusinfektionsundersøgelser.Vira med visse mutanter blev isoleret fra kliniske prøver og inficeret til Calu-3-celler.Detaljerede resultater om virusinfektionsundersøgelse kan læses i papiret.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Reference
Lin J, Tang C, Wei H, et al.Genomisk overvågning af SARS-CoV-2 afslører en Nsp1-deletionsvariant, der modulerer type I-interferonrespons[J].Cellevært og mikrobe, 2021.
Nyheder og højdepunkter sigter på at dele de seneste succesfulde cases med Biomarker Technologies, fange nye videnskabelige resultater såvel som fremtrædende teknikker anvendt under undersøgelsen.
Indlægstid: Jan-06-2022