MRNA-sekventering i fuld længde -PacBio
Service fordele
● Direkte udlæsning af cDNA-molekyle i fuld længde fra 3'-ende til 5'-ende
● Iso-form niveau opløsning i sekvensstruktur
● Transskriptioner med høj nøjagtighed og integritet
● Meget kompatibel med vaiours arter
● Stor sekventeringskapacitet med 4 PacBio Sequel II sekventeringsplatforme udstyret
● Stor erfaring med over 700 Pacbio-baserede RNA-sekventeringsprojekter
● BMKCloud-baseret resultatlevering: Tilpasset data-mining tilgængelig på platformen.
● Eftersalgsservice gælder i 3 måneder efter projektets afslutning
Service specifikationer
Platform: PacBio Sequel II
Sekvenseringsbibliotek: Poly A-beriget mRNA-bibliotek
Anbefalet dataudbytte: 20 Gb/prøve (afhængig af art)
FLNC（%）： ≥75%
*FLNC: Ikke-kimære transcipter i fuld længde
Bioinformatiske analyser
● Rådatabehandling
● Udskriftsidentifikation
● Sekvensstruktur
● Kvantificering af udtryk
● Funktionsanmærkning
Prøvekrav og levering
Prøvekrav:
Nukleotider:
| Konc.(ng/μl) | Mængde (μg) | Renhed | Integritet |
| ≥ 120 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Begrænset eller ingen protein- eller DNA-kontamination vist på gel. | For planter: RIN≥7,5; For dyr: RIN≥8,0; 5,0≥ 28S/18S≥1,0; begrænset eller ingen basislinjestigning |
Væv: Vægt (tør):≥1 g
*For væv, der er mindre end 5 mg, anbefaler vi at sende lynfrosset (i flydende nitrogen) vævsprøve.
Cellesuspension:Celletal = 3×106- 1×107
*Vi anbefaler at sende frosset cellelysat.I tilfælde af at cellen tæller mindre end 5×105, anbefales flashfrosset i flydende nitrogen, hvilket er at foretrække til mikroekstraktion.
Blodprøver:Volumen ≥1 ml
Mikroorganisme:Masse ≥ 1 g
Anbefalet prøvelevering
Beholder:
2 ml centrifugerør (stanniol anbefales ikke)
Prøvemærkning: Gruppe+replikat f.eks. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Forsendelse:
1. Tøris: Prøver skal pakkes i poser og begraves i tøris.
2. RNA-stabile rør: RNA-prøver kan tørres i RNA-stabiliseringsrør (f.eks. RNAstable®) og sendes i stuetemperatur.
Service Work Flow
Eksperimentdesign
Prøve levering
RNA-ekstraktion
Biblioteksbyggeri
Sekvensering
Dataanalyse
Eftersalgsservice
1.FLNC længdefordeling
Længden af ikke-kimærisk aflæsning i fuld længde (FLNC) angiver længden af cDNA i bibliotekskonstruktion.FLNC-længdefordeling er en afgørende indikator i evaluering af kvaliteten af bibliotekskonstruktion.
FLNC læse længdefordeling
2. Komplet ORF-regionlængdefordeling
Vi bruger TransDecoder til at forudsige proteinkodende regioner og tilsvarende aminosyresekvenser til at generere unigen sæt, som indeholder fuldstændig ikke-redundant transkriptinformation i alle prøver.
Komplet ORF-regionlængdefordeling
3.KEGG pathway berigelse analyse
Differentielt udtrykte transkripter (DET'er) kan identificeres ved at justere NGS-baserede RNA-sekventeringsdata på fuldlængde transskriptionssæt genereret af PacBio-sekventeringsdata.Disse DET'er kan behandles yderligere til forskellige funktionelle analyser, f.eks. KEGG-pathway-berigelsesanalyse.
DET KEGG pathway berigelse -Prik plot
BMK sag
Populus stamtranskriptomets udviklingsdynamik
Udgivet: Plantebioteknologisk tidsskrift, 2019
Sekvenseringsstrategi:
Prøvesamling:stammeregioner: apex, første internode(IN1), anden internode(IN2), tredje internode(IN3), internode(IN4) og internode(IN5) fra Nanlin895
NGS-sekvens:RNA fra 15 individer blev samlet som én biologisk prøve.Tre biologiske replikater af hvert punkt blev behandlet til NGS-sekvens
TGS-sekvens:Stængelregioner blev opdelt i tre regioner, dvs. apex, IN1-IN3 og IN4-IN5.Hver region blev behandlet til PacBio-sekventering med fire typer biblioteker: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb og 3-10 kb.
Nøgleresultater
1.I alt 87150 fuldlængde transkripter blev identificeret, hvori 2081 nye isoformer og 62058 nye alternative splejsede isoformer blev identificeret.
2.1187 lncRNA og 356 fusionsgener blev identificeret.
3. Fra primær vækst til sekundær vækst blev 15838 differentielt udtrykte transkripter fra 995 differentielt udtrykte gener identificeret.I alle DEG'er var 1216 transkriptionsfaktorer, hvoraf de fleste endnu ikke er blevet rapporteret.
4.GO berigelsesanalyse afslørede betydningen af celledeling og oxidationsreduktionsproces i primær og sekundær vækst.
Alternative splejsningsbegivenheder og forskellige isoformer
WGCNA-analyse på transkriptionsfaktorer
Reference
Chao Q, Gao ZF, Zhang D, et al.Populus stamtranskriptomets udviklingsdynamik.Plant Biotechnol J. 2019;17(1):206-219.doi:10.1111/pbi.12958
