METAGENOMEG
Genomau bacteriol cyflawn, caeedig o ficrobiomau gan ddefnyddio dilyniannu nanopor
Dilyniannu Nanopore |Metagenomeg |MAGs |Cylchrediad genom bacteriol |Microbiota perfedd
Uchafbwyntiau
1.Cyflwynwyd dull newydd o echdynnu darnau hir o DNA yn yr astudiaeth hon, a lwyddodd i echdynnu microgram o DNA pur, HMW a oedd yn addas ar gyfer dilyniannu darllen hir o 300 mg o stôl
2. Cyflwynwyd llif gwaith cydosod, Lathe, yn yr astudiaeth hon, lle cafodd MAGs eu cydosod gan ddarlleniadau hir a'u cywiro gan ddarlleniadau byr.
Gwerthuswyd 3.Lathe gan gymysgedd ffug.Cafodd 7 o bob 12 o facteria eu cydosod yn llwyddiannus i greu contigau sengl a chafodd 3 eu rhoi at ei gilydd yn bedwar contig neu lai.
Cymhwyswyd 4.Lathe ymhellach i samplau carthion, a gynhyrchodd 20 o genomau crwn, gan gynnwys Prevotella copri a'r ymgeisydd Cibiobacter sp., a oedd yn adnabyddus am fod yn gyfoethog mewn elfennau genetig symudol.
Prif Gyflawniad
Protocol echdynnu ar gyfer HWM DNA
Mae astudiaethau metagenomig perfedd sy'n seiliedig ar ddilyniant darllen hir wedi bod yn dioddef ers cryn dipyn o galedwch wrth dynnu DNA pwysau moleciwlaidd uchel (HMW) o stôl .Yn yr astudiaeth hon, cyflwynwyd protocol echdynnu sy'n seiliedig ar ensymau i osgoi cneifio helaeth trwy guro gleiniau mewn dulliau traddodiadol.Fel y dangosir yn y ffigur canlynol, cafodd y samplau eu trin yn gyntaf â choctel o ensymau, gan gynnwys ensym lytic, MetaPolyzyme, ac ati i ddiraddio waliau celloedd.Echdynnwyd DNA a ryddhawyd gan system ffenol-clorofform, ac yna treuliad Proteinase K ac RNase A, puro ar sail colofn a dewis maint SPRI.Llwyddodd y dull hwn i gynhyrchu microgramau o DNA HMW o 300m o stôl, sy'n bodloni gofynion dilyniannu darllen hir o ran ansawdd a maint.
Ffigur 1. Cynllun echdynnu DNA HWM
Cynllun llif y turn
Fel y disgrifir yn y ffigur canlynol, mae Lathe yn cynnwys proses bresennol o broses galw sylfaenol amrwd gan ddefnyddio Guppy.Yna mae Flye a Canu yn cynhyrchu dau gynulliad darllen hir ar wahân ac yna canfod a thynnu cam-gydosod.Mae'r ddau is-gynulliad yn cael eu huno â quickmerge.Ar ôl uno, mae cynulliadau mawr ar lefel megabase wedyn yn cael eu gwirio am gylchrediad.O ganlyniad, mae mireinio consensws ar y gwasanaethau hyn yn cael ei brosesu gyda darlleniadau byr.Mae genomau bacteriol wedi'u cydosod yn derfynol yn cael eu prosesu ar gyfer canfod a thynnu cam-gydosod terfynol.
Ffigur 2. Cynllun llif y cynulliad turn
Gwerthusiad o turn gyda chymysgedd bacteria ffug
Defnyddiwyd cymysgedd safonol ATCC 12 rhywogaeth yn cynnwys bacteria Gram-positif a Gram-negyddol i werthuso perfformiad llwyfan dilyniannu nanopore a Lathe yn y cynulliad MAG.Cynhyrchwyd cyfanswm o 30.3 Gb o ddata gan blatfform nanopor gyda N50 o 5.9 kb.Gwellodd turn y cynulliad N50 i 1.6 i 4-plyg i raddau helaeth o'i gymharu ag offer cydosod darllen hir eraill a 2 i 9-plyg o'i gymharu ag offer cydosod hybrid.O'r 12 genom bacteriol, cafodd saith eu cydosod yn contigau sengl (Ffigur 3. Circos gyda dot du).Cydosodwyd tri arall yn bedwar contig neu lai, lle'r oedd y cynulliad mwyaf anghyflawn yn cynnwys 83% o'r genom mewn un contig.
Ffigur 3. Cynulliadau genom mewn cymysgedd bacteriol 12 rhywogaeth diffiniedig
Cymhwyso turn mewn samplau carthion
Cymhwyswyd y dull hwn ymhellach i samplau carthion dynol er mwyn cymharu adnabyddiaeth organeb a chyflymder cydosod â dulliau presennol, darllen-cwmwl a dadansoddiad yn seiliedig ar ddarlleniad byr.O'r tri sampl dan sylw, cafwyd o leiaf 1 μg fesul 300 mg o fàs mewnbwn o'r echdyniad newydd sy'n seiliedig ar ensymau.Cynhyrchodd dilyniannu nanopor o'r DNA HMW hyn ddarlleniadau hir gyda N50 o 4.7 kb, 3.0kb a 3.0kb yn y drefn honno.Yn nodedig, dangosodd y dull presennol botensial mawr o ran canfod microbau o'i gymharu â dulliau presennol.Dangoswyd amrywiaeth alffa lefel rhywogaethau cymharol uwch yma o gymharu â darllen-byr a darllen-cwmwl.At hynny, adenillwyd pob genera o ddadansoddiadau darllen byr, hyd yn oed yn nodweddiadol organebau Gram-positif sy'n gwrthsefyll lysis, gan ddefnyddio'r dull hwn.
Ffigur 4. Amrywiaeth alffa a chydrannau tacanomig a bennir gan ddulliau Nanopore, darllen-byr a darllen-cwmwl
Roedd turn yn cynhyrchu cydosodiad cyfan llawer hirach N50 na chynulliad darllen-byr a darllen-cwmwl, er gwaethaf mewnbwn tair i chwe gwaith yn is o ddata crai.Cynhyrchwyd genomau drafft gan contig binning, lle dosbarthwyd y drafftiau yn “ansawdd uchel” neu “rhannol” yn seiliedig ar gyflawnrwydd, halogiad, genynnau craidd un copi, ac ati. Dangoswyd cydosodiad darllen hir lawer uwch contiguedd am gost is o gymharu i ddarllen byr a darllen-cwmwl.
Ffigur 5. Per-organeb cydosodiad contiguity pob dull
Ar ben hynny, mae'r dull cydosod presennol yn gallu cynhyrchu genomau crwn, caeedig.Yn y samplau carthion, casglwyd wyth genom contig sengl o ansawdd uchel a chyflawnodd pump o'r rhain gylchrediad union gywir.Roedd dull darllen hir hefyd yn dangos gallu trawiadol i ddatrys elfennau ailadroddus mewn genomau.Wedi'i gylchredegP. copriCynhyrchwyd genom gan y dull hwn, y gwyddys ei fod yn cynnwys llawer iawn o ailadrodd dilyniant.Nid oedd y cynulliad gorau o'r genom hwn trwy ddarllen byr a darllen-cwmwl erioed yn fwy na N50 o 130 kb, hyd yn oed gyda dyfnder cwmpas o 4800X.Cafodd yr elfennau rhif copi uchel hyn eu datrys yn llawn trwy ddull darllen hir, a ganfuwyd yn aml ar adegau torri gwasanaethau darllen-byr neu ddarllen-cwmwl.Adroddwyd am genom caeedig arall yn yr astudiaeth hon, y credwyd ei fod yn aelod o'r hyn a ddisgrifiwyd yn ddiweddarCibiobacterclad.Nodwyd pum ffag tybiedig yn y gwasanaeth caeedig hwn, yn amrywio o 8.5 i 65.9 kb.
Ffigur 6. Diagram circos o genomau caeedig P.copri a Cibiobacter sp.
Cyfeiriad
Moss, EL, Maghini, DG, a Bhatt, AS (2020).Genomau bacteriol cyflawn, caeedig o ficrobiomau gan ddefnyddio dilyniannu nanopor.Biotechnoleg natur,38(6), 701-707.
Tech ac Uchafbwyntiau yn anelu at rannu cymhwysiad llwyddiannus mwyaf diweddar o wahanol dechnolegau dilyniannu trwybwn uchel mewn amrywiol arena ymchwil yn ogystal â syniadau gwych mewn dylunio arbrofol a chloddio data.
Amser postio: Ionawr-07-2022