VYŽADUJE CELÝ GENOM
Genomické monitorování SARS-CoV-2 odhaluje variantu delece Nsp1, která moduluje odpověď na interferon typu I
Nanopore |Illumina |Resekvenování celého genomu |metagenomika |RNA-Seq |Sanger
Společnost Biomarker Technologies poskytla technickou podporu pro sekvenování vzorků v této studii.
Zvýraznění
1. Sekvenování genomu SARS-CoV-2 a fylognetická analýza identifikuje 35 rekurentních mutací včetně 31 SNP a 4 Indelů.
2. Potenciálně odhaluje asociace se 117 klinickými fenotypy
důležité mutace.
∆500-532 v kódující oblasti Nsp1 koreluje s nižším virem
3. zátěž a sérový IFN-β.
4. Virové izoláty s mutací ∆500-532 indukují nižší IFN-I
reakce v infikovaných buňkách.
Experimentální design
Úspěchy
1. Epidemiologický a genomický dozor COVID-19
Klinická data byla shromážděna v provincii Sichuan v Číně během období vypuknutí od 22. ledna 2020 do 20. února 2020. Testy qPCR v Sichuanu potvrdily celkem 538 případů COVID-19, z nichž 28,8 % bylo z provincie hlavní město.Potvrzené případy v S'-čchuanu exponenciálně vzrostly a dosáhly vrcholu 30. ledna.Údaje také potvrdily, že sociální distancování může být klíčovým faktorem v prevenci šíření viru.
Obrázek 1. Epidemiologická studie COVID-19 v provincii Sichuan, Čína
2. Konstrukce genomu SARS-CoV-2 a identifikace variant
S multiplexní PCR amplifikací následovanou sekvenováním nanopórů bylo vytvořeno celkem 310 téměř nebo částečně kompletních genomů od 248 pacientů s přibl.80 % genomů pokryto 10 čteními (střední hloubka: 0,39 M čtení na vzorek).
Obrázek 2. Frekvence jednotlivých variant v sečuánské kohortě
Z genomů SARS-CoV-2 bylo identifikováno celkem 104 SNP a 18 Indelů, z nichž 31 SNP a 4 Indely byly identifikovány jako rekurentní genetické varianty.Porovnáním se 169 vzorky z Wuhanu as 81 391 vysoce kvalitními sekvencemi veřejného genomu v GISAID bylo 29 z 35 nalezených variant prezentováno na jiných kontinentech.Pozoruhodně bylo zjištěno, že čtyři varianty včetně ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 a T13243C se vyskytují pouze v Sichuanu a Wuhanu a chybí v datech GISAID, což naznačuje, že tyto varianty byly velmi pravděpodobně importovány z Wuhanu, které splňují cestovní záznamy pacientů.
Evoluční analýza metodou maximální věrohodnosti (ML) a bayesovskými molekulárními hodinami byla zpracována na 88 nových virech ze Sichuanu a 250 upravených genomech z jiných oblastí.Genomy s ∆500-532 (delece v kódující oblasti Nsp1) byly ve fylogenetickém stromu nalezeny řídce distribuované.Haplotypová analýza na variantách Nsp1 identifikovala 5 z nich z více měst.Tyto výsledky naznačují, že ∆500-532 se vyskytoval ve více městech a mohl být importován vícekrát z Wuhanu.
Obrázek 2. Rekurentní genetické varianty a fylogenetická analýza v genomech SARS-CoV-2
3. Asociace rekurentních genetických variant s klinickými implikacemi
Se závažností COVID-19 bylo spojeno 117 klinických fenotypů, přičemž 19 fenotypů souvisejících se závažností bylo klasifikováno do závažných a nezávažných znaků.Vztah mezi těmito vlastnostmi a 35 rekurentními genetickými variantami byl vizualizován v bi-cluster heatmap.Analýza obohacení podobná GSEA ukázala, že ∆500-532 negativně koreluje s ESR, sérovým IFN-β a počtem CD3+CD8+ T buněk v krvi.Testy qPCR navíc ukázaly, že pacienti infikovaní virem s ∆500-532 měli nejvyšší hodnotu Ct, tj. nejnižší virovou zátěž.
Obrázek 3. Asociace 35 rekurentních genetických variant s klinickými fenotypy
4. Validace na klinických fenotypech spojených s virovou mutací
Aby bylo možné porozumět účinkům ∆500-532 na funkce Nsp1, byly buňky HEK239T transfekovány plasmidy exprimujícími plnou délku, WT Nsp1 a mutantní formy s delecemi.Profily transkriptomu každé ošetřené buňky HEK239T byly zpracovány pro analýzu PCA, což ukazuje, že deleční mutanty se shlukovaly relativně blíže a byly významně odlišné od WT Nsp1.Geny, které byly u mutantů významně upregulovány, byly obohaceny hlavně o „biosyntetický/metabolický proces peptidu“, „biogenezi ribonukleoproteinového komplexu“, „zacílení proteinu na membránu/ER“ atd. Navíc dvě delece vykazovaly odlišný expoziční vzor z WT.
Obrázek 4. Analýza transkriptomu na buňkách HEK239T transfekovaných WT Nsp1 a na buňkách s delecemi
Vlivy delecí na odpověď IFN-1 byly také testovány ve studii s nadměrnou expresí.Ukázalo se, že všechny testované delece snižují odpověď IFN-1 v transfekovaných buňkách HEK239T a A549 jak na úrovni transkriptomu, tak na úrovni proteinu.Je zajímavé, že významně down-regulované geny v delecích byly obohaceny o „obrannou reakci na virus“, „replikaci virového genomu“, „regulaci transkripce RNA polymerázou II“ a „odpověď na interferon typu I“.
Obrázek 5. Down regulace interferonových signálních drah u mutantu ∆500-532
V této studii byl dopad těchto delecí na virus dále potvrzen studiemi virové infekce.Viry s určitými mutanty byly izolovány z klinických vzorků a infikovány do buněk Calu-3.Podrobné výsledky studie virové infekce si můžete přečíst v článku.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Odkaz
Lin J, Tang C, Wei H a kol.Genomické monitorování SARS-CoV-2 odhaluje variantu s delecí Nsp1, která moduluje odpověď na interferon typu I[J].Buněčný hostitel a mikrob, 2021.
Novinky a hlavní události si klade za cíl sdílet nejnovější úspěšné případy s Biomarker Technologies, zachycovat nové vědecké úspěchy i prominentní techniky použité během studie.
Čas odeslání: leden-06-2022