Dlouhé nekódující sekvenování-Illumina
Výhody služby
● Servisní výhody
● Buněčně a tkáňově specifické
● Specifická fáze vyjadřuje a prezentuje dynamickou změnu výrazu
● Přesné vzorce vyjádření času a prostoru
● Společná analýza s daty mRNA.
● Doručování výsledků na bázi BMKCloud: Na platformě je k dispozici přizpůsobené dolování dat.
● Poprodejní služby platné 3 měsíce po dokončení projektu
Vzorové požadavky a dodání
| Knihovna | Plošina | Doporučené údaje | Data QC |
| vyčerpání rRNA | Illumina PE150 | 10 Gb | Q30≥85 % |
| Konc. (ng/μl) | množství (μg) | Čistota | Integrita |
| ≥ 100 | ≥ 0,5 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Omezená nebo žádná kontaminace proteiny nebo DNA na gelu. | Pro rostliny: RIN≥6,5; Pro zvířata: RIN≥7,0; 5,0≥28S/18S≥1,0; omezená nebo žádná základní elevace |
Nukleotidy:
Tkáň: Hmotnost (suchá): ≥1 g
*Pro tkáň menší než 5 mg doporučujeme odeslat bleskově zmrazený (v tekutém dusíku) vzorek tkáně.
Buněčná suspenze: Počet buněk = 3x107
*Doporučujeme zasílat zmrazený buněčný lyzát.V případě, že počet buněk je menší než 5×105, doporučuje se bleskově zmrazit v tekutém dusíku.
Vzorky krve:
PA×geneBloodRNATube;
6 ml TRIzolu a 2 ml krve (TRIzol: Krev = 3:1)
Doporučené doručení vzorku
Nádoba: 2 ml centrifugační zkumavka (nedoporučuje se cínová fólie)
Označení vzorků: Skupina+replikace např. A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Náklad:
1. Suchý led: Vzorky je třeba zabalit do sáčků a zahrabat do suchého ledu.
2. Zkumavky RNAstable: Vzorky RNA lze sušit ve zkumavce pro stabilizaci RNA (např. RNAstable®) a přepravovat při pokojové teplotě.
Tok servisní práce
Návrh experimentu
Vzorová dodávka
Extrakce RNA
Stavba knihovny
Sekvenování
Analýza dat
Poprodejní služby
Bioinformatika
1. Klasifikace LncRNA
LncRNA predikované čtyřmi software výše byly klasifikovány do 4 kategorií: lincRNA, anti-sense-LncRNA, intronic-LncRNA;sense-LncRNA.Klasifikace LncRNA byla ukázána na histogramu níže.
Klasifikace LncRNA
2.Cis-cílené geny analýzy obohacení DE-lncRNA
ClusterProfiler byl použit při analýze obohacení GO na cis-cílených genech diferenciálně exprimované lncRNA (DE-lncRNA), z hlediska biologických procesů, molekulárních funkcí a buněčných komponent.Analýza obohacení GO je proces k identifikaci významně obohacených termínů GO řízených DEG ve srovnání s celým genomem.Obohacené termíny byly prezentovány v histogramu, bublinovém grafu atd., jak je uvedeno níže.
Cis-cílené geny analýzy obohacení DE-lncRNA - bublinový graf
3. Porovnáním délky, počtu exonů, ORF a množství exprese mRNA a lncRNA můžeme porozumět rozdílům ve struktuře, sekvenci atd. mezi nimi a také ověřit, zda námi předpovídaná nová lncRNA odpovídá obecným charakteristikám.
Pouzdro BMK
Deregulovaný profil exprese lncRNA u myších plicních adenokarcinomů s mutací KRAS‐G12D a knockoutem P53
Publikováno:Journal of Cellular and Molecular Medicine,2019
Strategie sekvenování
Illumina
Kolekce vzorků
NONMMUT015812-knockdown KP (shRNA-2) buňky a negativní kontrolní (sh-Scr) buňky byly získány v den 6 specifické virové infekce.
Klíčové výsledky
Tato studie zkoumá aberantně exprimované lncRNA v myším plicním adenokarcinomu s knockoutem P53 a mutací KrasG12D.
1,6424 lncRNA bylo odlišně exprimováno (≥ 2násobná změna, P < 0,05).
2. Ze všech 210 lncRNA (FC≥8) byla exprese 11 lncRNA regulována P53, 33 lncRNA pomocí KRAS a 13 lncRNA hypoxií v primárních KP buňkách, v daném pořadí.
3.NONMMUT015812, který byl pozoruhodně up-regulován u myšího plicního adenokarcinomu a negativně regulován reexpresí P53, byl detekován za účelem analýzy jeho buněčné funkce.
4. Knockdown NONMMUT015812 pomocí shRNA snížil proliferační a migrační schopnosti KP buněk.NONMMUT015812 byl potenciální onkogen.
 Analýza KEGG dráhy odlišně exprimovaných genů v NONMMUT015812-knockdown KP buňkách |  Analýza genové ontologie odlišně exprimovaných genů v NONMMUT015812-knockdown KP buňkách |
Odkaz
Deregulovaný profil exprese lncRNA u myších plicních adenokarcinomů s mutací KRAS‐G12D a knockoutem P53[J].Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019, 23(10).DOI: 10.1111/jcmm.14584
