Sekvenování mRNA plné délky - Nanopore
Výhody služby
● Zkreslení nízké sekvence
● Odhalení molekul cDNA plné délky
● K pokrytí stejného počtu přepisů je potřeba méně dat
● Identifikace více izoforem na gen
● Kvantifikace exprese na úrovni izoforem
Specifikace služby
| Knihovna | Plošina | Doporučený datový výtěžek (Gb) | Kontrola kvality |
| cDNA-PCR (obohacený o Poly-A) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/vzorek (v závislosti na druhu) | Poměr po celé délce＞ 70 % Průměrné skóre kvality: Q10
|
Bioinformatické analýzy
●Zpracování surových dat
● Identifikace přepisu
● Alternativní spojování
● Kvantifikace exprese na úrovni genu a úrovni izoforem
● Diferenciální expresní analýza
● Anotace a rozšíření funkcí (DEG a DET)
Vzorové požadavky a dodání
Vzorové požadavky:
Nukleotidy:
| Konc. (ng/μl) | množství (μg) | Čistota | Integrita |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280 = 1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Omezená nebo žádná kontaminace proteiny nebo DNA na gelu. | Pro rostliny: RIN≥7,0; Pro zvířata: RIN≥7,5; 5,0≥28S/18S≥1,0; omezená nebo žádná základní elevace |
Tkáň: Hmotnost (suchá): ≥1 g
*Pro tkáň menší než 5 mg doporučujeme odeslat bleskově zmrazený (v tekutém dusíku) vzorek tkáně.
Buněčná suspenze: Počet buněk = 3x106- 1×107
*Doporučujeme zasílat zmrazený buněčný lyzát.V případě, že počet buněk je menší než 5×105, doporučuje se bleskově zmrazit v tekutém dusíku, což je vhodnější pro mikroextrakce.
Vzorky krve: Objem≥1 ml
Doporučené doručení vzorku
Nádoba: 2 ml centrifugační zkumavka (nedoporučuje se cínová fólie)
Označení vzorků: Skupina+replikace např. A1, A2, A3;B1, B2, B3......
Zásilka: 2、Suchý led: Vzorky je třeba zabalit do sáčků a zahrabat do suchého ledu.
- Zkumavky RNAstable: Vzorky RNA lze sušit ve zkumavce pro stabilizaci RNA (např. RNAstable®) a přepravovat při pokojové teplotě.
Tok servisní práce
Nukleotidy:
Vzorová dodávka
Stavba knihovny
Sekvenování
Analýza dat
Poprodejní služby
Tok servisní práce
Tkáň:
Návrh experimentu
Vzorová dodávka
Extrakce RNA
Stavba knihovny
Sekvenování
Analýza dat
Poprodejní služby
1.Diferenciální expresní analýza -Vulcano plot
Analýza diferenciální exprese může být zpracována jak na úrovni genu k identifikaci odlišně exprimovaných genů (DEG), tak na úrovni izoforem pro odlišnou identifikaci
vyjádřené přepisy (DET)
2.Hierarchická shluková tepelná mapa
3. Identifikace a klasifikace alternativních spojů
Astalavista může předvídat pět typů alternativních sestřihových událostí.
4.Alternativní polyadenylační (APA) identifikace a motiv na 50 bp proti směru od poly-A
Pouzdro BMK
Alternativní sestřihová identifikace a kvantifikace na úrovni izoforem pomocí sekvenování nanopórů plné délky transkriptomu
Publikováno:Nature Communications, 2020
Strategie sekvenování:
Seskupení: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutace K700E);3. Normální B-buňky
Strategie sekvenování: sekvenování 2D knihovny MinION, sekvenování 1D knihovny PromethION;krátká data ze stejných vzorků
Sekvenační platforma: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Klíčové výsledky
1.Identifikace alternativního spojování na úrovni izoforem
Long-read sekvence umožňuje identifikaci mutantu SF3B1K700E-změněná místa sestřihu na úrovni izoforem.Bylo zjištěno, že 35 alternativních 3′SS a 10 alternativních 5′SS jsou mezi SF3B1 významně rozdílně sestřiženéK700Ea SF3B1WT.33 z 35 změn bylo nově objeveno pomocí dlouhých sekvencí.
2. Kvantifikace alternativního sestřihu na úrovni izoforem
Exprese izoforem retence intronu (IR) v SF3B1K700Ea SF3B1WTbyly kvantifikovány na základě nanopórových sekvencí, což odhalilo globální down-regulaci IR izoforem v SF3B1K700E.
Odkaz
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV a kol.Charakterizace transkriptu plné délky mutace SF3B1 u chronické lymfocytární leukémie odhaluje downregulaci zadržených intronů[J].Příroda komunikace.
