METAGENOMIA
Genomi batterichi cumpleti è chjusi da i microbiomi utilizendu a sequenza di nanopori
Nanopore Sequencing |Metagenomica |MAGs |Circularization genomu bacterial |Microbiota intestinale
Highlights
1. Un metudu novu per estrazione di frammenti longu di DNA hè statu presentatu in stu studiu, chì hà ottenutu l'estrazione di microgrammu di DNA HMW puru adattatu per a sequenza longa di lettura da 300 mg di feci.
2.Un flussu di travagliu di l'assemblea, Lathe, hè statu introduttu in stu studiu, induve i MAG sò stati assemblati da letture longu è currette da leghje brevi.
3.Lathe hè stata evaluata da mock mixure.7 da 12 bacterias sò stati assemblati bè in cunti unichi è 3 sò stati assemblati in quattru o menu contigs.
4.Lathe hè stata più appiicata à i campioni di feci, chì hà generatu 20 genomes circularized, cumprese Prevotella copri è candidatu Cibiobacter sp., chì eranu cunnisciuti per esse ricchi in elementi genetichi mobili.
Principale Achievement
Protokollu di estrazione per HWM DNA
Studi metagenomici intestinali basati in sequenza di lettura longa sò stati longu soffrenu di durezza in l'estrazione di DNA di altu pesu moleculare (HMW) da e feci.In questu studiu, hè statu introduttu un protokollu di estrazione basatu à l'enzima per evità una cisura estensiva per batte di perle in i metudi tradiziunali.Comu mostra in a figura seguente, i campioni sò stati trattati prima cù un cocktail di enzimi, cumprese l'enzima litica, MetaPolyzyme, etc.L'ADN liberatu hè stata estratta da u sistema Phenol-cloroformu, seguita da a digestione Proteinase K è RNase A, purificazione basata in colonna è selezzione di taglia SPRI.Stu metudu hà sappiutu di pruduce microgrammi di DNA HMW da 300 m di feci, chì cumpone i requisiti di sequenziamentu di longa lettura in termini di qualità è quantità.
Figura 1. Schema di estrazione di DNA HWM
Schema flussu di Lathe
Cum'è discrittu in a figura seguente, Lathe cuntene un prucessu esistenti di u prucessu di basa di basa cruda cù Guppy.Dui assemblei di longa lettura sò poi pruduciuti da Flye è Canu per separatamente seguitu da a rilevazione è a rimozione di mis-assemblea.I dui sub-assemblei sò uniti cù quickmerge.Dopu à a fusione, i grandi assemblei à u livellu di megabase sò poi verificati per a circularizazione.In seguitu, u raffinamentu di cunsensu nantu à queste assemblee hè trattatu cù letture brevi.I genomi batterichi assemblati finali sò trattati per a rilevazione è a rimozione finale di mis-assemblea.
Figura 2. Scheme flussu di assemblea Lathe
Valutazione di Tornu cù una mistura di batteri simulati
Una mistura standard di 12 spezie ATCC chì comprende batteri Gram-positivi è Gram-negativi hè stata impiegata per valutà a prestazione di a piattaforma di sequenza di nanopori è Tornu in l'assemblea MAG.Un totale di dati 30.3 Gb hè statu generatu da a piattaforma nanopore cù N50 di 5.9 kb.U tornu hà largamente migliuratu l'assemblea N50 à 1,6 à 4 volte in paragunà à l'altri strumenti di assemblea di lettura longa è 2 à 9 volte in paragunà à l'arnesi di assemblea hibrida.Di 12 genomi bacterial, sette sò stati assemblati in cuntigghi unichi (Figura 3. Circos cù punti neri).Trè altri sò stati riuniti in quattru o menu contigs, in quale l'assemblea più incompleta cuntene 83% di u genoma in un unicu contig.
Figura 3. Assemblage di genoma in una mistura bacteriana definita di 12 spezie
Applicazione di tornu in campioni di feci
Stu metudu hè ancu appiicatu à i campioni di feci umani per paragunà l'identificazione di l'organismu è a contiguità di l'assemblea à i metudi esistenti, l'analisi basata nantu à a nuvola di lettura è a lettura corta.Da i trè campioni implicati, a nova estrazione basata nantu à l'enzima hà datu almenu 1 μg per 300 mg di massa di input.A sequenza di nanopori di questi DNA HMW hà generatu letture longu cù N50 di 4.7 kb, 3.0kb è 3.0kb rispettivamente.In particulare, u metudu attuale hà dimustratu un grande potenziale in a rilevazione microbiana paragunata à i metudi esistenti.A diversità alfa à livellu di spezie relativamente più altu hè stata mostrata quì paragunata à a lettura corta è a nuvola di lettura.Inoltre, tutti i generi da l'analisi di lettura corta, ancu l'organisimi Gram-positivi tipicamente resistenti à a lisi, sò stati recuperati da stu metudu.
Figura 4. A diversità alfa è i cumpunenti taxanomici determinati da Nanopore, metudi di lettura corta è di nuvola di lettura
Lathe hà datu assai più longu à l'assemblea N50 di l'assemblea di lettura corta è di lettura in nuvola, malgradu un input di trè à sei volte più bassu di dati crudi.Draft genomes sò stati pruduciuti da contig binning, in quale i drafts sò stati classificati in "di alta qualità" o "parziale" basatu annantu à a completezza, a contaminazione, i geni di core in una sola copia, etc. L'assemblea di lettura longa mostrava una contiguità assai più altu à u costu più bassu cumparatu. per leghje in breve è leghje-nuvola.
Figura 5. Contiguità di assemblea per-organismu di ogni metudu
Inoltre, l'approcciu di l'assemblea attuale hè capaci di pruduce genomi chjusi è circulari.In i campioni di feci, ottu genomi di alta qualità, single-contig sò stati assemblati è cinque di questi ottennu una circularizazione precisa.L'approcciu di lettura longa hà ancu mostratu una capacità impressiunanti per risolve elementi ripetitivi in i genomi.CircularizatiP. coprigenomu hè statu generatu da questu approcciu, chì hè cunnisciutu per cuntene un altu gradu di ripetizione di sequenza.U megliu assemblea di stu genoma da a lettura corta è a nuvola di lettura ùn hà mai superatu N50 di 130 kb, ancu cù a prufundità di copertura di 4800X.Questi elementi di u numeru elevatu di copie sò stati risolti cumplettamente da l'approcciu longu di lettura, chì spessu si trovanu à i punti di rottura di l'assemblee di lettura corta o di lettura in nuvola.Un altru genomu chjusu hè statu rapportatu in stu studiu, chì era cridutu per esse un membru di descrittu recentementeCibiobacterclade.Cinque fagi putativi sò stati identificati in questa assemblea chjusa, chì varieghja da 8,5 à 65,9 kb.
Figura 6. Circos diagram di genomi chjusi di P.copri è Cibiobacter sp.
Riferimentu
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Genomi batterichi cumpleti è chjusi da i microbiomi utilizendu a sequenza di nanopori.Biotecnologia di a natura,38(6), 701-707.
Tecnulugia è Highlights hà u scopu di sparta l'applicazioni più recenti di successu di diverse tecnulugia di sequenza d'alta produzzione in diverse aree di ricerca, è ancu idee brillanti in u disignu sperimentale è l'estrazione di dati.
Tempu di posta: 07-Jan-2022