TRASCRIPTOMICA
natura
CUMUNICAZIONI
A caratterizzazione di a trascrizione integrale di a mutazione SF3B1 in a leucemia linfocitica cronica revela a downregulation di introni ritenuti
Trascrizioni full-length|Nanopore sequencing|Analisi d'isoforme alternative
Sfondate
SMutazioni omatiche in u fattore di splicing SF3B1 hè stata largamente infurmata per associà cù diversi cancers, cumpresa a leucemia linfocitica crònica (CLL), melanoma uveal, cancru di pettu, etc.Tuttavia, i studii nantu à questi mudelli di splicing alternativu sò stati longu limitati à u livellu di l'avvenimentu è a mancanza di cunniscenze nantu à u livellu isoforme per via di a limitazione di trascrizioni assemblate di lettura corta.Quì, a piattaforma di sequenza di nanopori hè stata introdotta per generà trascrizioni di lunghezza completa, chì hà permessu l'inversione di l'isoforme AS.
Disegnu sperimentale
Esperimenti
Raggruppamentu:1. CLL-SF3B1 (WT) 2. CLL-SF3B1 (mutazione K700E);3. Célule B normale
Strategia di sequenza:Sequenza di biblioteca MinION 2D, Sequenza di biblioteca PromethION 1D;brevi lettura di dati da i stessi campioni
Piattaforma di sequenza:ONT Minion;ONT PromethION;
Analisi Bioinformatica
Risultati
Aun totale di 257 milioni di letture sò stati generati da 6 campioni CLL è 3 cellule B.In media, u 30,5% di queste letture sò state identificate cum'è trascrizioni full-length.
FL'analisi di l'isoforme alternative di ull-length di RNA (FLAIR) hè stata sviluppata per generà un inseme di isoforme d'alta fiducia.FLAIR pò esse riassuntu cum'è:
Nanopore leghje l'allineamentu: identificà a struttura di trascrizione generale basatu annantu à u genoma di riferimentu;
Splice junction currezzione: currettu sequenza errori (rossu) cù splice situ da o introni annotated, introni da brevi-lettura dati o dui;
Collapse: riassume l'isoforme rappresentative basate nantu à e catene di junction splice (set di primu passu).Selezziunate una alta fiducia in basa di u numeru di letture supportanti (Soglia: 3).
Figura 1. L'analisi FLAIR per identificà l'isoforme full-lenth assuciate cù a mutazione SF3B1 in CLL
FLAIR hà identificatu 326.699 isoforme spliced d'alta fiducia, u 90% di e quali sò novi isoforme.A maiò parte di sti isoforme senza annotazioni sò stati truvati per esse novi cumminzioni di junzioni splice cunnisciute (142,971), mentre chì u restu di l'isoforme novi cuntenenu intron (21,700) o esone novu (3594).
Le sequenze di lettura à longu permette l'identificazione di siti di splice mutanti SF3B1-K700E alterati à livellu isoforme.35 alternative 3'SS è 10 alternative 5'SS sò state trovate esse spliced significativamente sfarente trà SF3B1-K700E è SF3B1-WT.33 di e 35 alterazioni sò stati scuperti di novu da sequenze di lettura longa.In i dati Nanopore, a distribuzione di distanza trà SF3B1-K700E-altered 3'SSs à i picchi di siti canonichi hè intornu à -20 bp, chì hè significativamente differitu da una distribuzione di cuntrollu, simile à ciò chì hè statu rappurtatu in sequenze di lettura corta CLL.L'isoforme di u genu ERGIC3 sò stati analizati, induve una nova isoforma chì cuntene u situ di splice prossimale hè stata trovata più abbundante in SF3B1-K700E.I 3'SS proximali è distali sò stati assuciati cù mudelli AS distinti chì generanu isoforme multiple.
Figura 2. Alternative 3' splicing patterns identificatu cù dati di sequenza nanopore
L'analisi di l'usu di l'eventi IR hè stata longa limitata in l'analisi basata in brevi lettura per via di a fiducia in l'identificazione è a quantificazione IR.L'espressione di isoforme IR in SF3B1-K700E è SF3B1-WT sò state quantificate in basa di sequenze di nanopori, chì palesanu una regulazione globale di l'isoforme IR in SF3B1-K700E.
Figura 4. L'intensità di l'agricultura è a cunnessione di a reta in trè sistemi agriculi (A è B);Analisi forestale aleatoria (C) è Relazione trà intensità agricula è culunizazione AMF (D)
Figura 3. L'avvenimenti di ritenzione di l'Intron sò più forti regulati in CLL SF3B1-K700E
Tecnulugia
Nanopore Sequenza di lettura longa
NA sequencing anopore hè una tecnulugia di sequenza di signali elettrici in tempu reale di una sola molécula.
DL'ADN o l'RNA à doppiu filamentu si ligherà à a proteina nanoporosa incrustata in u biofilm è si stende sottu à a proteina di u mutore.
DI filamenti NA / RNA passanu à traversu a proteina di u canali nanopori à un certu ritmu sottu l'azzione di a differenza di tensione.
Molecules generanu segnali elettrici diffirenti secondu a struttura chimica.
RA deteczione in tempu di sequenze hè ottenuta da una chjama di basa.
Prestazione di sequenza di transcriptome full-length
√ Saturazione di dati
7 volte menu letture necessarie per ghjunghje à una saturazione di dati paragunabili.
√ Identificazione di a Struttura di Trascrizione
Identificazione di diverse varianti strutturali cù una lettura in piena lunghezza di cunsensu di ogni trascrizione
√ Analisi differenziale à livellu di trascrizione - Rivela i cambiamenti nascosti da letture brevi
Riferimentu
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.A caratterizzazione di a trascrizione integrale di a mutazione SF3B1 in a leucemia linfocitaria cronica revela una regulazione di l'intruni ritenuti [J].Comunicazioni Natura.
Tecnulugia è Highlights hà u scopu di sparta l'applicazioni più recenti di successu di diverse tecnulugia di sequenza d'alta produzzione in diverse aree di ricerca, è ancu idee brillanti in u disignu sperimentale è l'estrazione di dati.
Tempu di Postu: 08-Jan-2022