TRANSCRIPTOMICS
kinaiyahan
KOMUNIKASYON
Ang bug-os nga gitas-on nga transcript nga kinaiya sa SF3B1 mutation sa chronic lymphocytic leukemia nagpadayag sa downregulation sa gipabilin nga introns
Full-length nga mga transcript|Nanopore sequencing|Alternatibong isoform analysis
Background
Somatic mutations sa splicing factor SF3B1 kaylap nga gitaho nga nakig-uban sa lain-laing mga kanser, lakip na ang chronic lymphocytic leukemia(CLL), uveal melanoma, breast cancer, ug uban pa.Bisan pa, ang mga pagtuon sa kini nga mga alternatibo nga mga pattern sa splicing dugay na nga limitado sa lebel sa panghitabo ug kakulang sa kahibalo sa lebel sa isoform tungod sa limitasyon sa mubo nga pagbasa nga gitigum nga mga transcript.Dinhi, ang nanopore sequencing platform gipaila aron makamugna og full-length nga mga transcript, nga naghatag gahum sa inverstigation sa AS isoforms.
Eksperimental nga Disenyo
Mga eksperimento
Paggrupo:1. CLL-SF3B1(WT) 2. CLL-SF3B1(K700E mutation);3. Normal nga B-cells
Estratehiya sa pagkasunodsunod:Minion 2D library sequencing, PromethION 1D library sequencing;mubo nga pagbasa sa datos gikan sa parehas nga mga sample
Pagsunod-sunod nga plataporma:ONT Minion;ONT PromethION;
Pagtuki sa Bioinformatic
Resulta
Akinatibuk-ang 257 ka milyon nga mga pagbasa ang namugna gikan sa 6 ka CLL sample ug 3 B-cells.Sa aberids nga 30.5% niini nga mga nabasa giila isip full-length transcripts.
FAng ull-length nga alternatibo nga isoform analysis sa RNA(FLAIR) gimugna aron makamugna og set sa high-confidence isoforms.Ang FLAIR mahimong i-summarize ingon:
Nanopore reads alignment: pag-ila sa kinatibuk-ang transcript structure base sa reference genome;
Splice junction correction: husto nga sequence errors(pula) uban sa splice site gikan sa annotated introns, introns gikan sa mubo nga pagbasa nga data o pareho;
Collapse: i-summarize ang representatibo nga isoform base sa splice junction chains(first-pass set).Pilia ang taas nga pagsalig gikan sa base sa gidaghanon sa pagsuporta sa mga pagbasa(Threshold: 3).
Figure 1. Pag-analisa sa FLAIR aron mahibal-an ang mga full-lenth isoform nga may kalabotan sa mutation sa SF3B1 sa CLL
FNailhan sa LAIR ang 326,699 nga high-confidence spliced isoform, 90% niini mga nobela nga isoform.Kadaghanan sa mga wala nahibal-an nga isoform nakit-an nga mga nobela nga kombinasyon sa nahibal-an nga splice juntions (142,971), samtang ang nahabilin nga mga nobela nga isoform adunay sulud nga gipabilin nga intron (21,700) o nobela exon (3594).
LAng ong-read sequences naghatag gahum sa pag-ila sa mutant SF3B1-K700E -giusab nga splice site sa isoform-level.Ang 35 ka alternatibong 3'SSs ug 10 ka alternatibong 5'SSs nakit-an nga adunay dakong kalainan tali sa SF3B1-K700E ug SF3B1-WT.Ang 33 sa 35 ka mga pagbag-o bag-o lang nadiskobrehan sa dugay nang gibasa nga mga han-ay.Sa datos sa Nanopore, ang pag-apod-apod sa gilay-on tali sa SF3B1-K700E-giusab nga 3'SSs ngadto sa mga canonical nga mga dapit nga mga taluktok anaa sa palibot -20 bp, nga dakog kalainan gikan sa usa ka kontrol nga pag-apod-apod, susama sa gitaho sa CLL nga mubo nga pagbasa nga mga han-ay.Ang mga isoform sa ERGIC3 gene gisusi, diin ang usa ka nobela nga isoform nga adunay proximal splice site nakit-an nga mas daghan sa SF3B1-K700E.Ang parehas nga proximal ug distal nga 3'SS nalangkit sa lahi nga mga pattern sa AS nga nagpatunghag daghang mga isoform.
Figure 2. Alternatibong 3′ splicing patterns nga giila sa nanopore sequencing data
Ang pagtuki sa paggamit sa panghitabo sa IR dugay nang limitado sa mubo nga pagbasa base sa pagtuki tungod sa pagsalig sa IR identification ug quantification.Ang ekspresyon sa IR isoforms sa SF3B1-K700E ug SF3B1-WT gi-quantified base sa nanopore sequence, nga nagpadayag sa global down-regulation sa IR isoforms sa SF3B1-K700E.
Hulagway 4. Kakusog sa agrikultura ug pagkadugtong sa network sa tulo ka sistema sa pagpanguma (A ug B);Random nga pagtuki sa kalasangan(C) ug Relasyon tali sa intensidad sa agrikultura ug kolonisasyon sa AMF (D)
Figure 3. Ang mga panghitabo sa pag-renta sa intron mas kusgan nga gipaubos sa CLL SF3B1-K700E
Teknolohiya
Ang Nanopore Long-read Sequencing
NAng anopore sequencing usa ka molekula nga real-time nga electrical signal sequencing nga teknolohiya.
DAng ouble-stranded nga DNA o RNA mogapos sa nanoporous nga protina nga nasukip sa biofilm ug mag-unwinding ubos sa lead sa motor protein.
DAng mga strand sa NA / RNA moagi sa nanopore channel nga protina sa piho nga rate sa ilawom sa aksyon sa kalainan sa boltahe.
Mang mga olecule makamugna og lain-laing electrical signal sumala sa kemikal nga istruktura.
RAng eal-time detection sa mga sequence makab-ot pinaagi sa base calling.
Pagganap sa full-length transcriptome sequencing
√ Saturation sa Data
7-pilo nga mas gamay nga pagbasa nga gikinahanglan aron maabot ang susama nga saturation sa datos.
√ Transcript Structure Identification
Pag-ila sa lainlain nga mga variant sa istruktura nga adunay consensus nga bug-os nga pagbasa sa matag transcript
√ Transcript-level differential analysis -Ipadayag ang mga pagbag-o nga gitago sa mubo nga pagbasa
Reperensya
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, ug uban pa.Ang full-length nga transcript characterization sa SF3B1 mutation sa chronic lymphocytic leukemia nagpadayag sa downregulation sa gipabilin nga introns [J].Komunikasyon sa Kinaiyahan.
Tech ug Highlight nagtumong sa pagpaambit sa pinakabag-o nga malampuson nga aplikasyon sa lain-laing mga high-throughput sequencing nga mga teknolohiya sa nagkalain-laing reseach arena ingon man usab sa hayag nga mga ideya sa eksperimental nga disenyo ug data mining.
Oras sa pag-post: Ene-08-2022