METAGENÒMICA
Genomes bacterians complets i tancats de microbiomes mitjançant la seqüenciació de nanopors
Seqüenciació de nanopors |Metagenòmica |MAGs |Circularització del genoma bacterià |Microbiota intestinal
Destacats
1. En aquest estudi es va presentar un mètode nou per extreure fragments llargs d'ADN, que va aconseguir l'extracció de micrograms d'ADN HMW pur adequat per a la seqüenciació de lectura llarga a partir de 300 mg de femta.
2. En aquest estudi es va introduir un flux de treball de muntatge, Torn, on els MAG es van muntar mitjançant lectures llargues i es van corregir mitjançant lectures curtes.
3.El torn es va avaluar mitjançant una barreja simulada.7 de cada 12 bacteris es van reunir amb èxit en contigs únics i 3 es van reunir en quatre o menys contigs.
4. El torn es va aplicar més a mostres de femta, que van generar 20 genomes circularitzats, incloent Prevotella copri i el candidat Cibiobacter sp., que eren coneguts per ser rics en elements genètics mòbils.
Assoliment principal
Protocol d'extracció d'ADN HWM
Els estudis metagenòmics de l'intestí basats en la seqüenciació de lectura llarga han patit durant molt de temps la duresa en l'extracció d'ADN d'alt pes molecular (HMW) de les femtes.En aquest estudi, es va introduir un protocol d'extracció basat en enzims per evitar una cisalla extensa per batre de comptes en mètodes tradicionals.Com es mostra a la figura següent, les mostres es van tractar primer amb un còctel d'enzims, inclòs l'enzim lític, MetaPolyzyme, etc. per degradar les parets cel·lulars.L'ADN alliberat es va extreure mitjançant el sistema fenol-cloroform, seguit de la digestió de la Proteinasa K i la RNasa A, la purificació basada en columna i la selecció de la mida SPRI.Aquest mètode va aconseguir obtenir micrograms d'ADN HMW a partir de 300 m de femta, que compleixen els requisits de seqüenciació de lectura llarga tant en qualitat com en quantitat.
Figura 1. Esquema d'extracció d'ADN HWM
Esquema de flux de Torn
Tal com es descriu a la figura següent, Lathe conté el procés existent de procés de trucada base en brut que utilitza Guppy.A continuació, Flye i Canu produeixen dos conjunts de lectura llarga per separat, seguits de la detecció i eliminació d'un mal muntatge.Els dos subconjunts es fusionen amb la fusió ràpida.Després de la fusió, es comprova la circularització de grans conjunts a nivell de megabase.Posteriorment, el perfeccionament del consens sobre aquestes assemblees es processa amb lectures breus.Els genomes bacterians assemblats finals es processen per a la detecció i eliminació finals d'un mal muntatge.
Figura 2. Esquema de flux del muntatge del torn
Avaluació del torn amb una barreja de bacteris simulades
Es va utilitzar una barreja estàndard de 12 espècies ATCC que inclou bacteris Gram positius i Gram negatius per avaluar el rendiment de la plataforma de seqüenciació de nanoporos i Torn en el muntatge MAG.La plataforma nanopore va generar un total de dades de 30,3 Gb amb N50 de 5,9 kb.El torn va millorar en gran mesura el muntatge N50 d'1,6 a 4 vegades en comparació amb altres eines de muntatge de lectura llarga i de 2 a 9 vegades en comparació amb les eines de muntatge híbrides.De 12 genomes bacterians, set es van reunir en contigs únics (Figura 3. Circs amb punt negre).Tres més es van reunir en quatre o menys contigs, en els quals el conjunt més incomplet contenia el 83% del genoma en un sol contig.
Figura 3. Conjunts de genoma en una barreja bacteriana definida de 12 espècies
Aplicació de Torn en mostres de femta
Aquest mètode es va aplicar més a mostres de femta humana per comparar la identificació de l'organisme i la contigüitat del muntatge amb els mètodes existents, l'anàlisi basada en el núvol de lectura i la lectura curta.A partir de les tres mostres implicades, la nova extracció basada en enzims va produir almenys 1 μg per 300 mg de massa d'entrada.La seqüenciació de nanoporos d'aquest DNA HMW va generar lectures llargues amb N50 de 4,7 kb, 3,0 kb i 3,0 kb respectivament.En particular, el mètode actual mostra un gran potencial en la detecció microbiana en comparació amb els mètodes existents.Aquí es va mostrar una diversitat alfa a nivell d'espècie relativament més alta en comparació amb la lectura curta i el núvol de lectura.A més, tots els gèneres de l'anàlisi de lectura curta, fins i tot els organismes Gram-positius típicament resistents a la lisi, es van recuperar mitjançant aquest mètode.
Figura 4. Diversitat alfa i components taxonòmics determinats per Nanopore, mètodes de lectura curta i lectura en núvol
El torn va produir un conjunt complet N50 molt més llarg que el conjunt de lectura curta i de lectura en núvol, malgrat una entrada de dades en brut de tres a sis vegades més baixa.Els esborranys de genomes es van produir mitjançant contig binning, en què els esborranys es van classificar en "alta qualitat" o "parcials" segons la integritat, la contaminació, els gens bàsics d'una còpia, etc. El muntatge de lectura llarga va mostrar una contigüitat molt més alta a un cost més baix en comparació. a lectura curta i lectura al núvol.
Figura 5. Contigüitat de muntatge per organisme de cada mètode
A més, l'enfocament de muntatge actual és capaç de produir genomes circulars tancats.A les mostres de femta, es van reunir vuit genomes d'alta qualitat i d'un sol contig i cinc d'aquests van aconseguir una circularització precisa.L'enfocament de lectura llarga també va mostrar una capacitat impressionant per resoldre elements repetitius en genomes.CircularitzatP. copriEl genoma es va generar mitjançant aquest enfocament, que se sap que conté un alt grau de repetició de seqüències.El millor muntatge d'aquest genoma per lectura curta i lectura en núvol mai va superar N50 de 130 kb, fins i tot amb una profunditat de cobertura de 4800X.Aquests elements de gran nombre de còpies es van resoldre completament mitjançant un enfocament de lectura llarga, que sovint es trobava en els punts de ruptura dels conjunts de lectura curta o de lectura en núvol.En aquest estudi es va informar d'un altre genoma tancat, que es creia que era un membre del descrit recentmentCibiobacterclade.Es van identificar cinc fags putatius en aquest conjunt tancat, que oscil·laven entre 8,5 i 65,9 kb.
Figura 6. Diagrama de Circos dels genomes tancats de P.copri i Cibiobacter sp.
Referència
Moss, EL, Maghini, DG i Bhatt, AS (2020).Genomes bacterians complets i tancats de microbiomes mitjançant la seqüenciació de nanopors.Biotecnologia de la natura,38(6), 701-707.
Tecnologia i aspectes destacats té com a objectiu compartir l'aplicació més recent amb èxit de diferents tecnologies de seqüenciació d'alt rendiment en diversos àmbits de recerca, així com idees brillants en disseny experimental i mineria de dades.
Hora de publicació: 07-gen-2022