RESEQUÈNCIA TOTAL DEL GENOMA
El seguiment de la genòmica del SARS-CoV-2 descobreix una variant de supressió de Nsp1 que modula la resposta a l'interferó de tipus I
Nanopor |Il·lumina |Reseqüenciació del genoma sencer |metagenòmica |RNA-Seq |Sanger
Biomarker Technologies va proporcionar suport tècnic sobre la seqüenciació de mostres en aquest estudi.
Destacats
1.La seqüenciació del genoma del SARS-CoV-2 i l'anàlisi filognetica identifiquen 35 mutacions recurrents, incloent 31 SNP i 4 Indels.
2. L'associació amb 117 fenotips clínics revela potencialment
mutacions importants.
∆500-532 a la regió de codificació Nsp1 es correlaciona amb un virus més baix
3.càrrega i IFN-β sèric.
4. Els aïllats virals amb mutació ∆500-532 indueixen un IFN-I més baix
resposta a les cèl·lules infectades.
Disseny experimental
Assoliments
1. Vigilància epidemiològica i genòmica de la COVID-19
Les dades clíniques es van recollir a la província de Sichuan, Xina durant el període del brot del 22 de gener de 2020 al 20 de febrer de 2020. Es van confirmar un total de 538 casos de COVID-19 mitjançant proves de qPCR a Sichuan, el 28,8% dels quals eren de la província. capital.Els casos confirmats a Sichuan van augmentar exponencialment i van assolir el màxim el 30 de gener.A més, les dades van recolzar que el distanciament social pot ser un factor clau per prevenir la propagació del virus.
Figura 1. Estudi epidemiològic de COVID-19 a la província de Sichuan, Xina
2. Construcció del genoma del SARS-CoV-2 i identificació de variants
Amb l'amplificació de PCR múltiple seguida de la seqüenciació de nanopors, es van generar un total de 310 genomes gairebé complets o parcials de 248 pacients amb aprox.80% dels genomes coberts per 10 lectures (profunditat mitjana: 0,39 M lectures per mostra).
Figura 2. Freqüència de cada variant a la cohort de Sichuan
Es van identificar un total de 104 SNP i 18 Indels a partir dels genomes SARS-CoV-2, en els quals es van identificar 31 SNP i 4 Indels com a variants genètiques recurrents.En comparar-les amb 169 mostres de Wuhan i amb 81.391 seqüències del genoma publich d'alta qualitat a GISAID, 29 de les 35 variants trobades es van presentar en altres continents.En particular, quatre variants, incloses ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 i T13243C, només es van trobar a Sichuan i Wuhan i absents a les dades de GISAID, cosa que indica que és molt probable que aquestes variants es milloressin de Wuhan, que compleixen els requisits registres de viatge dels pacients.
L'anàlisi evolutiva amb mètode de màxima probabilitat (ML) i enfocaments de rellotge molecular bayesià es va processar en 88 virus nous de Sichuan i 250 genomes curats d'altres regions.Es van trobar genomes amb ∆500-532 (Supressions a la regió codificant Nsp1) distribuïts escassament a l'arbre filogenètic.L'anàlisi d'haplotips de variants Nsp1 va identificar 5 d'elles de diverses ciutats.Aquests resultats van suggerir que el ∆500-532 es va produir a diverses ciutats i es podria importar diverses vegades des de Wuhan.
Figura 2. Variants genètiques recurrents i anàlisi filogenètica en els genomes SARS-CoV-2
3. Associació de variants genètiques recurrents amb implicacions clíniques
Es van associar 117 fenotips clínics amb la gravetat de la COVID-19, on 19 fenotips relacionats amb la gravetat es van classificar en trets greus i no greus.La relació entre aquests trets i 35 variants genètiques recurrents es va visualitzar en un mapa de calor bi-clúster.Una anàlisi d'enriquiment classificat semblant a GSEA va demostrar que ∆500-532 està correlacionat negativament amb el recompte de cèl·lules T CD3+CD8+ a la sang, l'ESR, l'IFN-β sèric i el CD3+CD8+.A més, les proves de qPCR van demostrar que els pacients infectats amb virus que albergaven ∆500-532 tenien el valor de Ct més alt, és a dir, la càrrega viral més baixa.
Figura 3. Associacions de 35 variants genètiques recurrents amb fenotips clínics
4. Validació de fenotips clínics associats a mutacions virals
Per entendre els efectes de ∆500-532 sobre les funcions Nsp1, les cèl·lules HEK239T es van transfectar amb plasmidis que expressaven formes de longitud completa, WT Nsp1 i mutants amb supressions.Els perfils de transcriptoma de cada cèl·lula HEK239T tractada es van processar per a l'anàlisi de PCA, mostrant que els mutants de supressió es van agrupar relativament més a prop i eren significativament diferents de WT Nsp1.Els gens que estaven significativament regulats en els mutants es van enriquir principalment en "procés biosintètic/metabòlic de pèptids", "biogènesi del complex de ribonucleoproteïnes", "orientació de proteïnes a membrana/ER", etc. A més, dues supressions van mostrar un patró d'expressió diferent de WT.
Figura 4. Anàlisi del transcriptoma en cèl·lules HEK239T transfectades per WT Nsp1 i amb delecions
Els efectes de les supressions sobre la resposta d'IFN-1 també es van provar en un estudi sobreexpressat.Es va demostrar que totes les supressions provades reduïen la resposta d'IFN-1 a les cèl·lules HEK239T i A549 transfectades tant a nivell de transcriptoma com a nivell de proteïnes.Curiosament, els gens significativament regulats a la baixa en les supressions es van enriquir en "resposta de defensa al virus", "replicació del genoma viral", "regulació de la transcripció per ARN polimerasa II" i "resposta a l'interferó tipus I".
Figura 5. Regulació a la baixa de les vies de senyalització de l'interferó en el mutant ∆500-532
En aquest estudi, l'impacte d'aquestes supressions sobre el virus es va confirmar encara més mitjançant estudis d'infecció viral.Els virus amb determinats mutants es van aïllar de mostres clíniques i es van infectar amb cèl·lules Calu-3.Els resultats detallats de l'estudi de la infecció viral es poden llegir al document.
doi:10.1016/j.chom.2021.01.015
Referència
Lin J, Tang C, Wei H, et al.El seguiment genòmic del SARS-CoV-2 descobreix una variant de supressió de Nsp1 que modula la resposta a l'interferó de tipus I [J].Amfitrió cel·lular i microbi, 2021.
Notícies i més destacats té com a objectiu compartir els últims casos d'èxit amb Biomarker Technologies, capturant nous èxits científics així com tècniques destacades aplicades durant l'estudi.
Hora de publicació: 06-gen-2022