METAGENOMIKA
Kompletni, zatvoreni bakterijski genomi iz mikrobioma pomoću sekvenciranja nanopora
Nanopore Sequencing |Metagenomika |MAGs |Cirkularizacija genoma bakterija |Mikrobiota crijeva
Highlights
1. U ovoj studiji predstavljena je nova metoda za ekstrakciju dugih fragmenata DNK, koja je postigla ekstrakciju mikrograma čiste HMW DNK pogodne za sekvenciranje dugog čitanja iz 300 mg stolice
2. U ovoj studiji uveden je radni tok montaže, Lathe, gdje su MAG-ovi sastavljeni dugim čitanjem i ispravljeni kratkim čitanjima.
3.Strug je ocjenjivan lažnom mješavinom.7 od 12 bakterija uspješno je sastavljeno u pojedinačne kontige, a 3 su sastavljene u četiri ili manje kontiga.
4. Lathe je dalje primijenjen na uzorke stolice, koji su generirali 20 cirkulariziranih genoma, uključujući Prevotella copri i kandidata Cibiobacter sp., koji su bili poznati po tome što su bogati mobilnim genetskim elementima.
Glavno dostignuće
Protokol ekstrakcije za HWM DNK
Dugo čitane metagenomske studije crijeva zasnovane na sekvenciranju dugo su patile od tvrdoće pri ekstrakciji DNK visoke molekularne težine (HMW) iz stolice.U ovoj studiji uveden je protokol ekstrakcije baziran na enzimima kako bi se izbjeglo ekstenzivno smicanje udarcima zrna u tradicionalnim metodama.Kao što je prikazano na sljedećoj slici, uzorci su prvo tretirani koktelom enzima, uključujući litički enzim, MetaPolyzyme, itd. kako bi se razgradili ćelijski zidovi.Oslobođena DNK ekstrahovana je fenol-hloroform sistemom, nakon čega je usledila digestija proteinaze K i RNaze A, prečišćavanje na bazi kolone i odabir veličine SPRI.Ova metoda je uspjela da dobije mikrograme HMW DNK iz 300 m stolice, što ispunjava zahtjeve sekvencioniranja dugog čitanja u pogledu kvaliteta i kvantiteta.
Slika 1. Šema ekstrakcije HWM DNK
Šema toka struga
Kao što je opisano na sljedećoj slici, Lathe sadrži postojeći proces sirovog procesa osnovnog pozivanja koristeći Guppy.Flye i Canu zatim proizvode dva sklopa koji se dugo čitaju odvojeno nakon čega slijedi otkrivanje i uklanjanje pogrešnog sklapanja.Dva podsklopa su spojena brzim spajanjem.Nakon spajanja, veliki sklopovi na nivou megabaze se zatim provjeravaju za cirkularizaciju.Nakon toga, preciziranje konsenzusa na ovim sklopovima se obrađuje kratkim čitanjem.Konačno sastavljeni bakterijski genomi se obrađuju za konačno otkrivanje i uklanjanje pogrešnog sastavljanja.
Slika 2. Šema toka sklopa struga
Procjena Lathea s lažnom mješavinom bakterija
Standardna mješavina ATCC 12 vrsta koja se sastoji od Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija korištena je za procjenu performansi platforme za sekvenciranje nanopora i Strugara u MAG sklopu.Ukupno 30,3 Gb podataka generisano je nanopore platformom sa N50 od 5,9 kb.Strug je u velikoj mjeri poboljšao montažu N50 na 1,6 do 4 puta u odnosu na druge alate za dugo čitanje i 2 do 9 puta u odnosu na hibridne alate za montažu.Od 12 bakterijskih genoma, sedam je sastavljeno u pojedinačne kontige (Slika 3. Cirkos sa crnom tačkom).Još tri su sastavljena u četiri ili manje kontiga, u kojima je najnepotpuniji sklop sadržavao 83% genoma u jednom kontigu.
Slika 3. Sklopovi genoma u definiranoj mješavini bakterija od 12 vrsta
Primjena Lathea u uzorcima stolice
Ova metoda je dalje primijenjena na uzorke ljudske stolice kako bi se uporedila identifikacija organizma i kontignost sklopa sa postojećim metodama, čitanjem u oblaku i analizom zasnovanom na kratkom čitanju.Od tri uključena uzorka, nova ekstrakcija na bazi enzima dala je najmanje 1 μg na 300 mg ulazne mase.Sekvenciranje nanopora ove HMW DNK generiralo je dugo čitanje sa N50 od 4,7 kb, 3,0 kb i 3,0 kb respektivno.Značajno je da je sadašnja metoda pokazala veliki potencijal u detekciji mikroba u odnosu na postojeće metode.Ovdje je prikazana relativno veća alfa raznolikost na nivou vrste u poređenju sa kratko čitanjem i čitanjem u oblaku.Štaviše, svi rodovi iz analize kratkog čitanja, čak i tipično gram-pozitivni organizmi otporni na lizu, pronađeni su ovom metodom.
Slika 4. Alfa raznolikost i taksanomske komponente određene Nanopore, metodama kratkog čitanja i čitanja-oblaka
Lathe je dao mnogo dužu celinu N50 od sklopa za kratko čitanje i čitanje u oblaku, uprkos tri do šest puta manjem unosu neobrađenih podataka.Nacrti genoma su proizvedeni kontig binningom, u kojem su nacrti klasifikovani u "visokokvalitetne" ili "djelimične" na osnovu potpunosti, kontaminacije, jednokopijskih gena jezgra, itd. Dugo čitani sklop pokazao je mnogo veći spoj uz nižu cijenu u poređenju sa na kratko čitanje i čitanje u oblaku.
Slika 5. Neprekidnost sklopa po organizmu svake metode
Štaviše, sadašnji pristup sastavljanju je sposoban da proizvede zatvorene, kružne genome.U uzorcima stolice sastavljeno je osam visokokvalitetnih jednokontig genoma, a pet od njih je postiglo perciznu cirkularizaciju.Pristup koji se dugo čitao pokazao je i impresivan kapacitet u rješavanju repetitivnih elemenata u genomima.CircularizedP. coprigenom je generiran ovim pristupom, za koji je poznato da sadrži visok stepen ponavljanja sekvence.Najbolji sklop ovog genoma putem kratkog čitanja i čitanja-oblaka nikada nije premašio N50 od 130 kb, čak i sa dubinom pokrivenosti od 4800X.Ovi elementi velikog broja kopija u potpunosti su riješeni pristupom dugog čitanja, koji se često nalazi na prijelomnim točkama sklopova za kratko čitanje ili čitanje-oblak.U ovoj studiji prijavljen je još jedan zatvoreni genom, za koji se vjerovalo da je član nedavno opisanogCibiobacterclade.Pet navodnih faga je identifikovano u ovom zatvorenom skupu, u rasponu od 8,5 do 65,9 kb.
Slika 6. Circos dijagram zatvorenih genoma P.copri i Cibiobacter sp.
Referenca
Moss, EL, Maghini, DG, & Bhatt, AS (2020).Kompletni, zatvoreni bakterijski genomi iz mikrobioma pomoću sekvenciranja nanopora.Prirodna biotehnologija,38(6), 701-707.
Tech and Highlights ima za cilj dijeljenje najnovije uspješne primjene različitih tehnologija sekvenciranja visoke propusnosti u različitim istraživačkim arenama, kao i briljantnih ideja u eksperimentalnom dizajnu i rudarenju podataka.
Vrijeme objave: Jan-07-2022