Sekveniranje mRNA pune dužine-Nanopore
Prednosti usluge
● Pristrasnost niske sekvence
● Otkrivanje cDNK molekula pune dužine
● Potrebno je manje podataka za pokrivanje istog broja transkripata
● Identifikacija više izoforma po genu
● Kvantifikacija ekspresije na nivou izoforme
Specifikacije usluge
| Biblioteka | Platforma | Preporučeni kapacitet podataka (Gb) | Kontrola kvaliteta |
| cDNA-PCR (obogaćen poli-A) | Nanopore PromethION P48 | 6 Gb/uzorak (u zavisnosti od vrste) | Odnos pune dužine＞70% Prosječna ocjena kvalitete: Q10
|
Bioinformatičke analize
●Obrada sirovih podataka
● Identifikacija transkripta
● Alternativno spajanje
● Kvantifikacija ekspresije na nivou gena i nivou izoforme
● Analiza diferencijalnog izraza
● Napomene i obogaćivanje funkcija (DEG i DET)
Zahtjevi za uzorke i dostava
Uzorci zahtjeva:
nukleotidi:
| Konc. (ng/μl) | Količina (μg) | Čistoća | Integritet |
| ≥ 100 | ≥ 0,6 | OD260/280=1,7-2,5 OD260/230=0,5-2,5 Ograničena ili nikakva kontaminacija proteina ili DNK prikazana na gelu. | Za biljke: RIN≥7,0; Za životinje: RIN≥7,5; 5.0≥28S/18S≥1.0; ograničeno ili nikakvo podizanje osnovne linije |
Markivo: Težina (suvo): ≥1 g
*Za tkivo manje od 5 mg, preporučujemo da pošaljete fleš zamrznut (u tečnom azotu) uzorak tkiva.
Suspenzija ćelija: Broj ćelija = 3×106- 1×107
*Preporučujemo slanje zamrznutog ćelijskog lizata.U slučaju da ta ćelija broji manji od 5×105, preporučuje se brzo zamrzavanje u tečnom azotu, što je poželjno za mikro ekstrakciju.
Uzorci krvi: Volumen≥1 ml
Preporučena dostava uzorka
Spremnik: epruveta za centrifugiranje od 2 ml (ne preporučuje se limena folija)
Označavanje uzorka: Grupa+replikacija npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...
Isporuka: 2、Suhi led: Uzorci se moraju spakovati u vreće i zakopati u suvi led.
- RNK stabilne epruvete: Uzorci RNK se mogu sušiti u RNA stabilizacijskoj cijevi (npr. RNAstable®) i otpremiti na sobnoj temperaturi.
Tok rada usluge
nukleotidi:
Isporuka uzorka
Izgradnja biblioteke
Sekvenciranje
Analiza podataka
Usluge nakon prodaje
Tok rada usluge
tkivo:
Dizajn eksperimenta
Isporuka uzorka
Ekstrakcija RNK
Izgradnja biblioteke
Sekvenciranje
Analiza podataka
Usluge nakon prodaje
1.Analiza diferencijalnog izraza -Vulkanski dijagram
Analiza diferencijalne ekspresije može se obraditi i na nivou gena za identifikaciju diferencijalno izraženih gena (DEG) i na nivou izoforme da bi se identifikovali različito
ekspresirani transkripti (DETs)
2.Hijerarhijska mapa klastera
3. Alternativna identifikacija i klasifikacija spajanja
Astalavista može predvidjeti pet vrsta alternativnih događaja spajanja.
4.Identifikacija i motiv alternativne poliadenilacije (APA) na 50 bp uzvodno od poli-A
BMK Case
Alternativna identifikacija spajanja i kvantifikacija na nivou izoforme sekvenciranjem transkriptoma pune dužine nanopora
Objavljeno:Prirodne komunikacije, 2020
Strategija sekvenciranja:
Grupisanje: 1. CLL-SF3B1(WT);2. CLL-SF3B1 (mutacija K700E);3. Normalne B-ćelije
Strategija sekvenciranja: MinION 2D sekvenciranje biblioteke, PromethION 1D sekvenciranje biblioteke;kratko pročitani podaci iz istih uzoraka
Platforma za sekvenciranje: Nanopore MinION;Nanopore PromethION;
Ključni rezultati
1. Alternativna identifikacija spajanja na nivou izoforme
Dugo čitane sekvence omogućavaju identifikaciju mutanta SF3B1K700E-izmijenjena mjesta spajanja na nivou izoforme.Utvrđeno je da su 35 alternativnih 3′SS i 10 alternativnih 5′SS značajno različito spojeni između SF3B1K700Ei SF3B1WT.33 od 35 izmjena su novootkrivene dugo čitanim sekvencama.
2. Kvantifikacija alternativnog spajanja na nivou izoforme
Ekspresija izoformi zadržavanja introna (IR) u SF3B1K700Ei SF3B1WTsu kvantificirani na osnovu sekvenci nanopora, otkrivajući globalnu regulaciju IR izoforma u SF3B1K700E.
Referenca
Tang AD, Soulette CM, Baren MJV, et al.Karakterizacija transkripta pune dužine mutacije SF3B1 kod hronične limfocitne leukemije otkriva smanjenje regulacije zadržanih introna[J].Nature Communications.
