Proizvodi

Sekvenciranje mRNA pune dužine -PacBio

Sekvencioniranje mRNA pune dužine -PacBio Featured Image

De novosekvenciranje transkriptoma pune dužine, takođe poznato kaoDe novoIso-Seq koristi prednosti PacBio sekvencera u dužini čitanja, što omogućava sekvenciranje cDNK molekula pune dužine bez ikakvih prekida.Ovo u potpunosti izbjegava sve greške nastale u koracima sastavljanja transkripta i konstruira unigene skupove s rezolucijom na nivou izoforme.Ovaj unigenski skup pruža moćne genetske informacije kao „referentni genom“ na nivou transkriptoma.Osim toga, u kombinaciji s podacima sekvenciranja sljedeće generacije, ova usluga omogućava preciznu kvantifikaciju ekspresije na nivou izoforme.

Platforma: PacBio Sequel II

Biblioteka: SMRT biblioteka zvona

Kontaktiraj nas

Detalji usluge

Demo Results

Studija slučaja

Prednosti usluge

● Direktno očitavanje cDNK molekula pune dužine od 3'-kraja do 5'-kraja

● Rezolucija nivoa iso-forme u strukturi sekvence

● Transkripti visoke preciznosti i integriteta

● Veoma kompatibilan sa vaiours vrstama

● Veliki kapacitet sekvenciranja sa 4 opremljene PacBio Sequel II platforme za sekvenciranje

● Visoko iskustvo sa preko 700 projekata sekvenciranja RNK zasnovanih na Pacbio-u

● Isporuka rezultata zasnovana na BMKCloud-u: Prilagođeno rudarenje podataka dostupno na platformi.

● Usluge nakon prodaje vrijede 3 mjeseca po završetku projekta

Specifikacije usluge

Platforma: PacBio Sequel II

Biblioteka sekvenciranja: Biblioteka mRNA obogaćena poli A

Preporučeni prinos podataka: 20 Gb/uzorak (ovisno o vrsti)

FLNC (%): ≥75%

*FLNC: Nehimerni transkripti pune dužine

Bioinformatičke analize

● Obrada sirovih podataka

● Identifikacija transkripta

● Struktura sekvence

● Kvantifikacija izraza

● Napomena o funkciji

Zahtjevi za uzorke i dostava

Uzorci zahtjeva:

nukleotidi:

Konc. (ng/μl)

Količina (μg)

Čistoća

Integritet

≥ 120

≥ 0,6

OD260/280=1,7-2,5

OD260/230=0,5-2,5

Ograničena ili nikakva kontaminacija proteina ili DNK prikazana na gelu.

Za biljke: RIN≥7,5;

Za životinje: RIN≥8,0;

5,0≥ 28S/18S≥1,0;

ograničeno ili nikakvo podizanje osnovne linije

Tkivo: Težina (suvo):≥1 g
*Za tkivo manje od 5 mg, preporučujemo da pošaljete fleš zamrznut (u tečnom azotu) uzorak tkiva.

ćelijska suspenzija:Broj ćelija = 3×10⁶- 1×10⁷
*Preporučujemo slanje zamrznutog ćelijskog lizata.U slučaju da ta ćelija broji manji od 5×10⁵, preporučuje se brzo zamrzavanje u tečnom azotu, što je poželjno za mikro ekstrakciju.

Uzorci krvi:Volumen≥1 mL

mikroorganizam:Masa ≥ 1 g

Preporučena dostava uzorka

Kontejner:
2 ml epruveta za centrifugiranje (ne preporučuje se limena folija)
Označavanje uzorka: Grupa+replikacija npr. A1, A2, A3;B1, B2, B3... ...

pošiljka:

1. Suhi led: Uzorci se moraju spakovati u vreće i zakopati u suvi led.
2. RNK stabilne epruvete: Uzorci RNK se mogu osušiti u RNA stabilizacijskoj epruveti (npr. RNAstable®) i poslati na sobnoj temperaturi.

Tok rada usluge

Dizajn eksperimenta

Isporuka uzorka

Ekstrakcija RNK

Izgradnja biblioteke

Sekvenciranje

Analiza podataka

Usluge nakon prodaje

Prethodno: Eukariotska mRNA Sequencing-Illumina

Sljedeći: Sekveniranje mRNA pune dužine-Nanopore

1. FLNC raspodjela dužine

Dužina nehimernog čitanja pune dužine (FLNC) označava dužinu cDNK u konstrukciji biblioteke.Distribucija dužine FLNC-a je ključni indikator u vrednovanju kvaliteta izgradnje biblioteke.

mRNA-FLNC-distribucija dužine čitanja

FLNC raspodjela dužine čitanja

2. Kompletna distribucija dužine ORF regiona

Koristimo TransDecoder da predvidimo regione koji kodiraju proteine i odgovarajuće sekvence aminokiselina za generisanje unigenih skupova, koji sadrže potpune neredundantne informacije o transkriptu u svim uzorcima.

mRNA-kompletna-ORF-dužina-distribucija

Kompletna distribucija dužine ORF regiona

3.KEGG analiza obogaćivanja puta

Diferencijalno izraženi transkripti (DET) mogu se identifikovati usklađivanjem podataka sekvenciranja RNK zasnovanih na NGS-u na kompletima transkripta pune dužine generisanih PacBio podacima sekvenciranja.Ovi DET se mogu dalje obraditi za različite funkcionalne analize, npr. analizu obogaćivanja KEGG puta.

mRNA-DEG-KEGG-puta-obogaćivanje

Obogaćivanje puta DET KEGG - Tačkasta grafika

BMK Case

Razvojna dinamika transkriptoma stabla Populus

Objavljeno: Plant Biotechnology Journal, 2019

Strategija sekvenciranja:
Zbirka uzoraka:regioni stabljike: vrh, prva internodija (IN1), druga internodija (IN2), treća internodija (IN3), internod (IN4) i internod (IN5) iz Nanlin895
NGS-sekvencija:RNK 15 individua je objedinjena kao jedan biološki uzorak.Tri biološke replike svake tačke su obrađene za NGS sekvencu
TGS sekvenca:Regije stabljike su podijeljene u tri regije, odnosno apex, IN1-IN3 i IN4-IN5.Svaki region je obrađen za PacBio sekvenciranje sa četiri tipa biblioteka: 0-1 kb, 1-2 kb, 2-3 kb i 3-10 kb.

Ključni rezultati

1. Identificirano je ukupno 87150 transkripata pune dužine, u kojima je identificirano 2081 novih izoforma i 62058 novih alternativnih spojenih izoforma.
Identificirano je 2.1187 lncRNA i 356 fuzionih gena.
3. Od primarnog do sekundarnog rasta, identifikovano je 15838 diferencijalno eksprimiranih transkripata iz 995 različito eksprimiranih gena.U svim DEG-ovima, 1216 su bili faktori transkripcije, od kojih većina još nije prijavljena.
4.GO analiza obogaćivanja otkrila je značaj ćelijske diobe i procesa oksidacije-redukcije u primarnom i sekundarnom rastu.