ЧОВЕШКА ГЕНОМИЯ
природна генетика
Секвенирането с дълго четене идентифицира GGC повторни експанзии в NOTCH2NLC, свързани с болест на невронно интрануклеарно включване
ONT повторно секвениране |Илюмина |Секвениране на целия екзом |CRISPR-Cas9 ONT насочено секвениране |РНК-последователност |ONT 5mC извикване на метилиране
Акценти
1. Чрез анализ на връзката на голямо семейство NIID бяха идентифицирани два свързани региона.
2. ONT базирано на продължително четене секвениране и Cas-9 медиирано обогатяване ONT секвениране откри потенциална генетична причина за NIID, GGC повтарящи се експанзии в 5' UTR на NOTCH2NLC.Това проучване съобщава за повторни експанзии в човешки специфични гени за първи път, които се развиват чрез сегментни дублирания.
3. Секвенирането на РНК разкри анормални антисенс транскрипти в началото или вътре в GGC повторени региони на разширяване в NOTCH2NLC.
Заден план
NИнтрануклеарно включване на еозинофилна болест (NIID) е прогресивно и фатално невродегенеративно заболяване, което се характеризира с наличието на еозинофилни хиалинови интрануклеарни включвания в централната и периферната нервна система.Силно вариабилните му клинични прояви създават големи трудности при диагностицирането до въвеждането на кожна биопсия.Въпреки това, методите, базирани на хистопатология, все още страдат от погрешна диагноза, което изисква генетично разбиране на NIID.
постижения
Анализ на връзките
SСеквенирането на целия геном (WGS) и секвенирането на целия екзом (WES) на основата на последователно четене беше извършено върху голямо семейство NIID (13 засегнати и 7 незасегнати члена).Анализът на връзката на SNPs, извлечени от тези данни, разкрива само два свързани региона: регион от 3,5 Mb при 1p36.31-p36.22 (максимален LOD=2,32) и регион от 58,1 Mb при 1p22.1-q21.3 (максимален LOD: 4,21 ).Въпреки това, не са идентифицирани патогенни SNP или CNV в тези свързани региони.
GGC повтаря разширения в NOTCH2NLC
Nбазираното на анопор секвениране беше обработено на 13 засегнати и 4 незасегнати члена от 8 семейства (друг засегнат член беше секвениран от Pacbio long read секвенираща платформа.).Дълго четени данни разкриват свързани с болестта GGC повторни експанзии в 5' UTR на NOTCH2NLC генно картографиране към 58,1 Mb свързан регион (Фигура 1).Тези повтарящи се експанзии също бяха идентифицирани във всички 40 спорадични случая на NIID, тествани с RP-PCR.
Cбеше използвано as-9 медиирано целево секвениране върху нанопорна платформа за постигане на по-високо покритие на четене при повторение на NOTCH2NLC (100 X-1,795 X).Тези консенсусни последователности се съгласуваха добре с предишни открития относно повторните разширения на GGC.Освен това {(GGA)n (GGC)n}n повторенията бяха идентифицирани като потенциален генетичен маркер за фенотип с доминираща слабост (Фигура 2).
Фигура 1. Свързана със заболяването повторна експанзия, идентифицирана в екзон 1 на NOTCH2NLC изоформи.
Фигура 2. Консенсусни последователности на повторение на NPTCH2NLC при пациенти с NIID с (*) или без доминиращ фенотип на слабост
NГените OTCH2NL са специфични за човека гени, за които се смята, че играят жизненоважна роля в еволюцията на човешкия мозък и неврологичните заболявания.Въпреки това, три свързани с NOTCH2 гена (NOTCH2NLA, NOTCH2NLB и NOTCH2NLC) с >99,1% идентичност на последователността не бяха разрешени до последното сглобяване на човешкия геном.Секвенирането без синтез и дълго четене на нанопорна платформа показа забележителни предимства при разрешаването на региони с висока прилика и (GGC)n повторения със 100% GC-богат.
GGC повтаря разширения в NOTCH2NLC
Tсеквенирането на ранкриптома беше обработено на 2 засегнати и 2 незасегнати члена.Нормализираната дълбочина на четене беше изчислена върху сенс и антисенс вериги нагоре по течението на първите екзони на NOTCH2NL паралози.Анормални антисенс транскрипти са открити само в засегнатите случаи, които се намират в началото или вътре в региона на повторение на разширението (лилави пикове във F1-14 и F1-16 на Фигура 3.).Освен това бяха идентифицирани 54 DEG и всички бяха обогатени с GO и MPO термини, свързани с невронни функции.
Фигура 3. Нормализирана дълбочина на четене нагоре от първия екзон на NOTCH2NLC в незасегнати (горе) и засегнати (долу) случаи.
технология
Oxford Nanopore Teghnologies (ONT)
Nанопорното секвениране се отличава от другите платформи за секвениране по това, че нуклеотидите се четат директно без процес на синтез на ДНК.Когато една нишка ДНК преминава през протеинова пора с наноразмер (нанопора), различни нуклеотиди генерират различни йонни потоци, които могат да бъдат уловени и прехвърлени в последователност от бази.Самата платформа за секвениране на ONT не показва очевидно техническо ограничение за дължината на четене на ДНК.Поради това са налични ултра-дълги четения (ULR) за сглобяване на геном с високо качество.Нещо повече, тези изключително дълги четения, които са достатъчно дълги, за да пресекат сложни характеристики на последователност или структурни вариации, помагат да се преодолеят ограниченията на последователността на кратко четене тук.
Секвениране на нанопори
Идентификация на вариация на структурата (SV).
Sсеквенирането без синтез до голяма степен запазва информацията за метилиране на ДНК върху шаблона.Метилираните A, T, C и G генерират различни йонни потоци от неметилираните, които могат да бъдат разчетени директно от платформата.Секвенирането на нанопори дава възможност за профилиране на целия геном както на 5mC, така и на 6mA при разделителна способност на един нуклеотид.
справка
Jun Sone и др.ал.Секвенирането с дълго четене идентифицира GGC повтарящи се експанзии в NOTCH2NLC, свързани с болест на невронно интрануклеарно включване.Nature Genetics (2019)
Технологии и акценти има за цел да сподели най-новото успешно приложение на различни технологии за секвениране с висока производителност в различни изследователски среди, както и брилянтни идеи в експерименталния дизайн и извличането на данни.
Време на публикуване: 6 януари 2022 г