Приложение на базирано на нанопори повторно секвениране при идентифициране на генетични варианти на COVID19

РЕСКВЕНЦИЯ НА ЦЯЛ ГЕНОМ

Геномното наблюдение на SARS-CoV-2 разкрива вариант на делеция на Nsp1, който модулира реакцията на интерферон тип I

Biomarker Technologies предостави техническа поддръжка за секвениране на проби в това проучване.

Акценти

1. Секвенирането на генома на SARS-CoV-2 и филогенетичният анализ идентифицират 35 повтарящи се мутации, включително 31 SNPs и 4 Indels.

2. Асоциацията със 117 клинични фенотипа разкрива потенциално
важни мутации.

∆500-532 в Nsp1 кодираща област корелира с по-нисък вирус
3. натоварване и серумен IFN-β.

4. Вирусни изолати с мутация ∆500-532 индуцират по-нисък IFN-I
отговор в заразените клетки.

Експериментален дизайн

постижения

1. Епидемиологично и геномно наблюдение на COVID-19

Клиничните данни бяха събрани в провинция Съчуан, Китай през периода на епидемията от 22 януари 2020 г. до 20 февруари 2020 г. Общо 538 случая на COVID-19 бяха потвърдени чрез qPCR тестове в Съчуан, 28,8% от които бяха от провинцията капитал.Потвърдените случаи в Съчуан се увеличиха експоненциално, достигайки своя връх на 30 януари.Освен това данните подкрепят, че социалното дистанциране може да бъде ключов фактор за предотвратяване на разпространението на вируса.

Фигура 1. Епидемиологично проучване на COVID-19 в провинция Съчуан, Китай

2. Конструкция на генома на SARS-CoV-2 и идентифициране на варианти

С мултиплексна PCR амплификация, последвана от секвениране на нанопори, бяха генерирани общо 310 почти или частично пълни генома от 248 пациенти с прибл.80% от геномите са обхванати от 10 четения (Средна дълбочина: 0,39 M четения на проба).

Фигура 2. Честота на всеки вариант в съчуанската кохорта

Общо 104 SNPs и 18 Indels бяха идентифицирани от геноми на SARS-CoV-2, в които 31 SNPs и 4 Indels бяха идентифицирани като повтарящи се генетични варианти.Чрез сравняването им със 169 проби от Ухан и с 81 391 висококачествени публични геномни последователности в GISAID, 29 от откритите 35 варианта са представени на други континенти.Трябва да се отбележи, че четири варианта, включително ∆500-532, ACC18108AT, ∆729-737 и T13243C, са открити само в Съчуан и Ухан и липсват в данните на GISAID, което показва, че е много вероятно тези варианти да бъдат внесени от Ухан, които отговарят на пътни досиета на пациенти.

Еволюционен анализ с метод на максимална вероятност (ML) и подходи на Bayesian молекулярен часовник бяха обработени върху 88 нови вируса от Съчуан и 250 курирани генома от други региони.Геноми с ∆500-532 (Делеции в Nsp1 кодиращ регион) бяха открити разпределени рядко във филогенетичното дърво.Анализът на хаплотипа на варианти на Nsp1 идентифицира 5 от тях от множество градове.Тези резултати предполагат, че ∆500-532 се е появил в множество градове и може да бъде внесен многократно от Ухан.

Фигура 2. Повтарящи се генетични варианти и филогенетичен анализ в геномите на SARS-CoV-2

3. Асоциация на повтарящи се генетични варианти с клинично значение

117 клинични фенотипа бяха свързани с тежестта на COVID-19, като 19 свързани с тежестта фенотипа бяха класифицирани в тежки и леки черти.Връзката между тези черти и 35 повтарящи се генетични варианта бяха визуализирани в топлинна карта на два клъстера.Подобен на GSEA класиран анализ на обогатяване показва, че ∆500-532 има отрицателна корелация с ESR, серумния IFN-β и броя на CD3+CD8+ Т клетките в кръвта.Нещо повече, qPCR тестовете показват, че пациентите, заразени с вирус, носещ ∆500-532, имат най-високата стойност на Ct, т.е. най-ниското вирусно натоварване.

Фигура 3. Асоциации на 35 повтарящи се генетични варианта с клинични фенотипове

4. Валидиране на клинични фенотипове, свързани с вирусни мутации

За да се разбере влиянието на ∆500-532 върху функциите на Nsp1, HEK239T клетките бяха трансфектирани с плазмиди, експресиращи пълна дължина, WT Nsp1 и мутантни форми с делеции.Транскриптомните профили на всяка третирана HEK239T клетка бяха обработени за PCA анализ, показвайки, че делеционните мутанти са групирани относително по-близо и са значително различни от WT Nsp1.Гените, които са значително регулирани нагоре в мутантите, са основно обогатени в „пептиден биосинтетичен/метаболитен процес“, „биогенеза на рибонуклеопротеиновия комплекс“, „насочване на протеин към мембрана/ER“ и т.н. Освен това, две делеции показват различен модел на експресия от WT.

Фигура 4. Анализ на транскриптоми върху HEK239T клетки, трансфектирани от WT Nsp1 и този с делеции

Влиянието на делециите върху отговора на IFN-1 също беше тествано в изследване на свръхекспресия.Показано е, че всички тествани делеции намаляват реакцията на IFN-1 в трансфектирани HEK239T и A549 клетки както на ниво транскриптом, така и на ниво протеин.Интересното е, че значително по-ниско регулираните гени в делециите са обогатени в „отговор на защита срещу вирус“, „репликация на вирусен геном“, „регулиране на транскрипция от РНК полимераза II“ и „отговор към интерферон тип I“.

Фигура 5. Регулиране надолу на интерферонови сигнални пътища в ∆500-532 мутант

В това проучване въздействието на тези делеции върху вируса беше допълнително потвърдено от проучвания за вирусни инфекции.Вируси с определени мутанти бяха изолирани от клинични проби и заразени в Calu-3 клетки.Подробни резултати от изследване на вирусни инфекции можете да прочетете в статията.
направи:10.1016/j.chom.2021.01.015

справка

Lin J, Tang C, Wei H, et al.Геномното наблюдение на SARS-CoV-2 разкрива вариант на делеция на Nsp1, който модулира отговора на интерферон тип I [J].Клетъчен гостоприемник и микроб, 2021 г.

Новини и Акценти има за цел да сподели най-новите успешни случаи с Biomarker Technologies, да улови нови научни постижения, както и видни техники, приложени по време на проучването.

Време на публикуване: 6 януари 2022 г